人抗核周因子抗体(APF)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗核周因子抗体(APF)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中血管活性肽酶抑制剂(VPI)的含量。

人抗核周因子抗体(APF)ELISA试剂盒实验原理

人抗核周因子抗体(APF)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人血管活性肽酶抑制剂(VPI)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的抗核周因子抗体(APF)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人抗核周因子抗体(APF)ELISA试剂盒

样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于类风湿关节炎的血清学诊断及其对早期诊断的意义研究

对600余例进行了抗核周因子（APF）、抗角蛋白抗体（AKA）、抗Sa抗体及抗RA33／36抗体检测，其中RA237例、非RA265例、诊断未肯定的关节痛／关节炎病人116例。研究目的希探索这些抗体对RA诊断的敏感性及特异性，并综合判断它们对诊断早期RA的价值。APF以人颊粘膜细胞为抗原底物，AKA以Wistar大白鼠食道中段切片为抗原底物，皆用间接免疫荧光法进行检测。Sa抗原从人新鲜胎盘中提取，用免疫印迹法检测抗Sa抗体。抗RA33／36抗体检测分别采用Hela细胞和腹水Ehrlich瘤细胞提取的核抗原，用免疫印迹法进行检测。

结果显示，APF检测以＞1：20为阳性，对RA诊断的敏感性48.67％，特异性91.57％。AKA的敏感性44.13％，特异性89.01％。抗Sa抗体的敏感性36.68％，特异性91.55％。抗RA33／36用腹水Ehrlich瘤细胞核抗原检测的敏感性34.76％，特异性89.76％。出现这四种抗体中任何1种以上的敏感性82.81％，特异性67.92％；2种以上敏感性54.17％，特异性91.32％；3种以上敏感性24.49％，特异性99.62％；4种抗体同时出现敏感性仅2.55％，特异性100％。抗体出现和病程的相关性不大，但病程一年以内的RA可出现这四种抗体，阳性率由高到低依次为抗Sa抗体47.37％，APF42.11％，抗RA33／36 28.57％，AKA15.69％。116例未肯定诊断的关节痛／关节炎患者随访4～18个月后，APF阳性的29例中最后确诊为RA20例（68.97％）；AKA30例中确诊RA16例（53.33％）；抗Sa抗体39例中确诊RA19例（48.72％）。以上三种抗体阳性组虽然也有确诊为非RA的，但例数很少。

以上三种自身抗体阴性组追随后确定为RA者比例不高，而发展为肯定非RA的患者明显比阳性组多，两组比较差异有显著性（p＜0.05）。抗RA33／36 23例阳性患者追随后确诊为RA10例（43.48％），非RA3例（13.05％）。86例抗RA33／36抗体阴性患者确诊为RA21例（24.42％），确诊为非RA者17例（19.77％），两组差异无显著性（p＞0.05）。

参考文献

[1]A new serum factor in patients with rheumatoid arthritis:the antiperinuclear factor.Nienhuis RL F,Mandema E,Smids C.Annals of the Rheumatic Diseases.1964

[2]Antiintermediate filament antilament antibodies,antikeratin antibody,antiperinuelear factor in rheumatoid arthritis??and infectious mononucleosis.Kataaha PK,Mortazavi-Milani SM,Russell G,et al.Annals of the Rheumatic Diseases.1985

[3]The cytokeratin-aggregating protein filaggrin is the target of the so-callled’antikerin antibodies’,specific for rheumatoid arthritis.Simon M,Gibal E,Sebbag M,et al.The Journal of Clinical Investigation.1993

[4]Antiintermediate filament antilament antibodies,antikeratin antibody,antiperinuclear factor in rheumatoid arthritis and infectious mononucleosis.Kataaha PK,Mortazavi-Miluni SM,Russell G,et al.Annals of the Rheumatic Diseases.1985

[5]李小峰.类风湿关节炎的血清学诊断及其对早期诊断的意义[D].中国协和医科大学,1998.