人冠状动脉内皮细胞的应用

背景^[1-3]

人冠状动脉内皮细胞提取于人心脏组织，提取纯化之后立即冻存。每管含有细胞数>5×105cells/ml，此细胞通过vWF/Factor VIII和CD31(P-CAM)免疫荧光染色验证，经测试不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。细胞可以达到15倍增。

内皮细胞通过分泌内皮源性血管收缩因子和内皮源性血管舒张因子，调节和降解血管活性肽以及内皮细胞表面的酶，达到进一步调节血管张力的功能。这些功能在不同的部位，不同器官的血管，以及大循环和微循环之间均存在着不同。人心脏微血管内皮细胞对于心肌细胞的功能同时具有生理和病理的效应。它通过分泌NO、内皮素-1、前列腺素、腺苷酸嘌呤、利钠肽以及其它的物质调节心肌细胞的功能。研究发现该效应在体内和体外培养都存在。CMEC也具有酶活性，特别是ACE/激肽酶活性，此酶活性能够调节心脏内局部血管紧张素II和缓激肽的水平。

人冠状动脉内皮细胞

细胞接收后的处理方法

1）收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染。

2）在显微镜下确认细胞生长状态时，在低倍镜（4或5X物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X和20×物镜下，同时给细胞拍照各2-3张（10×，20×都要拍照），作为售后的依据。

3）观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；马血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于miR-105对人冠状动脉内皮细胞作用的初步研究

动脉粥样硬化（AS）是一种常见疾病,严重危害人类健康。它是缺血性心脑血管疾病的主要病理基础,包括冠心病、脑血管病、血栓栓塞病等,是动脉血管壁的慢性炎性病变。AS的致病机理到目前为止还未被彻底查明。基于以上原因,有效药物也尚未被研发出来。越来越多的证据表明,micro RNA在许多疾病的病理生理中起着重要的作用,尤其是心血管疾病的发生和发展。

研究已经证实micro RNA可作用于血管内皮细胞通过靶向作用于不同的相关基因参与多种生物学功能。这些micro RNA可以是胞内产生,也可以来源于胞外。血液中高密度脂蛋白（HDL）颗粒被发现可以作为载体运输micro RNA至靶细胞影响其生物学功能。并且有报道发现家族性高胆固醇血症患者中HDL-miRNA明显不同于正常对照。正常情况下HDL通过清除多余的胆固醇可以预防AS。在系统和血管炎症作用下可以将HDL转化为一种功能失调的形式,从而削弱抗AS的效果。因此,HDL-miRNA可能在AS中起到重要作用。

通过体外实验来初步探究miR-105对动脉内皮细胞功能的影响,为进一步研究HDL-miR-105在AS中的作用提供先期研究依据。方法体外研究:在体外通过将miR-105 mimics转染人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）,并设立空白对照组（B）和mimics NC组,观察miR-105对HCAEC增殖、迁移及细胞周期等功能的影响。同时通过Western blot方法检测HCAEC各处理组ICAM1的表达。利用在线工具Targetscan、miRDB及miRMap预测miR-105的靶基因。

利用双荧光素酶实验验证ICAM1是否为miR-105靶基因。结果通过体外实验发现miR-105可抑制HCAEC增殖与迁移能力;miR-105可使内皮细胞ICAM-1表达降低,双荧光素酶实验结果表明ICAM1不是miR-105靶基因,说明miR-105是间接调控ICAM-1影响内皮细胞功能;运用生物信息学方法预测miR-105靶基因,结果表明miR-105可能调控内皮细胞VEGF通路。

结论miR-105可以调控HCAEC细胞功能,包括增殖、迁移、周期、ICAM-1表达等,生物信息学方法预测miR-105参与调控内皮细胞VEGF通路,是AS的潜在靶点。

参考文献

[1]Atherosclerosis:Insights into Vascular Pathobiology and Outlook to Novel Treatments.[J].Wolf Marc P,Hunziker Patrick.Journal of cardiovascular translational research.2020(prep)

[2]Contribution of IL-7/7R genetic polymorphisms in coronary heart disease in Chinese Han population[J].Yuxiao Sun,Jifeng Yan,Jiliang Zhang,Aifeng Wang,Jie Zou,Chuanyu Gao.International Immunopharmacology.2020(C)

[3]IL-7R blockade reduces post-myocardial infarction-induced atherosclerotic plaque inflammation in ApoE?/-mice[J].Peter M.Mihailovic,Wai Man Lio,Juliana Yano,Jianchang Zhou,Xiaoning Zhao,Kuang-Yuh Chyu,Prediman K.Shah,Bojan Cercek,Paul C.Dimayuga.Biochemistry and Biophysics Reports.2019

[4]Overexpression of miR-223 inhibits foam cell formation by inducing autophagy in vascular smooth muscle cells.[J].Wu Weibin,Shan Zhen,Wang Rui,Chang Guangqi,Wang Mian,Wu Ridong,Li Zilun,Zhang Chunxiang,Li Wen,Wang Shenming.American journal of translational research.2019(7)

[5]丁毅.miR-105对人冠状动脉内皮细胞作用的初步研究[D].武汉大学,2020.