SGC-7901 人胃腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

SGC-7901人胃腺癌细胞是1979年建系；这株细胞源自一位56岁女性胃腺癌患者的淋巴结转移灶。RPMI-1640培养12天，细胞开始生长，首次传代10天；31个月中传代186代。免疫抑制的ICR小鼠、乳犬皮下移植成功，家兔、乳犬眼前房移植成功；淋巴结转移，从小鼠皮下侵袭至肌层。STR检测发现SGC7901、SMMC7721、QGY7701、QGY7703、QSG7701、Ho-8910PM、Ho-8910、BEL7402等多株细胞为同一遗传背景，怀疑彼此间存在交叉污染。

SGC-7901人胃腺癌细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备1640（推荐iCell-0002）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于Fucoidan对人胃腺癌SGC7901细胞诱导的淋巴管生成的抑制作用研究

血管内皮生长因子C（VEGF-C）及其受体血管内皮细胞生长因子受体3（VEGFR-3）是促进淋巴管新生的重要因素。基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）参与降解细胞外基质进而导致肿瘤的侵袭转移。PI3K/Akt/NF-κB信号通路是一条与细胞增殖、迁移和侵袭密切相关的信号通路,能够促进肿瘤的发生发展。趋化因子1（CXCL1）是一种能够促进肿瘤侵袭和进一步提高恶性肿瘤转移的趋化因子。

方法:1.采用MTT法检测fucoidan对SGC7901细胞活力的影响,同时通过流式细胞术（Flow cytometry）检测fucoidan对SGC7901细胞周期的影响。

2. 采用Transwell小室法检测fucoidan对SGC7901细胞迁移和侵袭能力的影响。

3. 采用ELISA法检测fucoidan对SGC7901细胞分泌的MMP-2,MMP-9,TIMP-1和VEGF-C的影响,采用RT-PCR法检测fucoidan对SGC7901细胞VEGF-CmRNA水平的影响。

4. Western blot检测fucoidan对SGC7901细胞中信号通路NF-κB/PI3K/Akt的影响。

5. 采用共培养方法检测fucoidan对SGC7901细胞对HLEC细胞管样结构形成能力的影响,采用Western blot检测共培养体系下,fucoidan对HLEC细胞中VEGFR-3和p-AKT蛋白水平的影响。

6. Transwell小室法检测CXCL1对SGC7901细胞侵袭能力的影响,ELISA法检测fucoidan作用下CXCL1对SGC7901细胞MMP-2的分泌的影响,免疫荧光法检测fucoidan对裸鼠体内CXCL1的表达水平的影响。

7. SGC7901胃腺癌细胞建立裸鼠肿瘤模型,免疫荧光双标记法检测fucoidan对裸鼠胃腺癌生长以及淋巴管密度（LVD）的影响。

结果:1.MTT实验结果表明fucoidan抑制SGC7901细胞活力。流式细胞术结果显示,fucoidan通过阻滞G0/G1期使细胞无法转向S期而产生抑制作用。

2. Transwell实验结果显示fucoidan抑制SGC7901细胞迁移侵袭能力。

3. ELISA实验结果表明fucoidan抑制SGC7901细胞MMP-2,MMP-9,TIMP-1和VEGF-C的分泌。RT-PCR结果显示在mRNA水平,fucoidan抑制vegf-c的表达。

4. Western blot法检测结果表明fucoidan能够下调PI3K,Akt磷酸化水平的表达以及NF-κB蛋白表达从而影响PI3K/Akt/NF-кB信号通路的表达。

5. 共培养条件下,成管实验结果显示fucoidan能够抑制SGC7901细胞与HLEC细胞共培养下HLEC细胞的成管能力。Western blot结果显示fucoidan下调HLEC中VEGFR-3和p-AKT表达。

6. Transwell和ELISA实验结果表明fucoidan抑制CXCL1对SGC7901细胞侵袭的促进作用,免疫荧光实验显示fucoidan抑制裸鼠肿瘤中CXCL1的表达。7.动物实验结果显示fucoidan在肿瘤生长和肿瘤诱导的淋巴管新生方面具有抑制作用。

结论:Fucoidan抑制SGC7901细胞增殖,迁移,侵袭以及SGC7901细胞诱导的淋巴管新生可能与抑制VEGF-C分泌,下调VEGFR-3的表达以及钝化PI3K/Akt/NF-кB信号通路有关。

参考文献

[1]CXCL8 promotes the invasion of human osteosarcoma cells by regulation of PI3K/Akt signaling pathway[J].Hai Jiang,Xiaowei Wang,Wusheng Miao,Bing Wang,Yusheng Qiu.APMIS.2017(9)

[2]Clinicopathologic significance of the CXCL1-CXCR2 axis in the tumor microenvironment of gastric carcinoma.[J].Kasashima Hiroaki,Yashiro Masakazu,Nakamae Hirohisa,Masuda Go,Kinoshita Haruhito,Morisaki Tamami,Fukuoka Tatsunari,Hasegawa Tsuyoshi,Nakane Takahiko,Hino Masayuki,Hirakawa Kosei,Ohira Masaichi.PloS one.2017(6)

[3]CXCL1 from tumor-associated lymphatic endothelial cells drives gastric cancer cell into lymphatic system via activating integrinβ1/FAK/AKT signaling[J].Zhixiong Wang,Zhao Wang,Guanghua Li,Hui Wu,Kaiyu Sun,Jianhui Chen,Yun Feng,Chuangqi Chen,Shirong Cai,Jianbo Xu,Yulong He.Cancer Letters.2017

[4]Inhibition of MT1-MMP proteolytic function and ERK1/2 signalling influences cell migration and invasion through changes in MMP-2 and MMP-9 levels[J].Mario A.Cepeda,Caitlin L.Evered,Jacob J.H.Pelling,Sashko Damjanovski.Journal of Cell Communication and Signaling.2017(2)

[5]高子翔.Fucoidan对人胃腺癌SGC7901细胞诱导的淋巴管生成的抑制作用[D].大连医科大学,2018.