RAJI细胞的应用

背景^[1-3]

RAJI细胞即淋巴瘤细胞，RAJI是一种淋巴母细胞样，也称黑人Burkitt淋巴瘤细胞。

特征特性：Raji细胞由Pulvertaft RJV于1963年从一位11岁黑人男孩的左上颌骨的Burkitt淋巴瘤中分离建立的，是个人类造血系统的连续传代细胞，为B细胞起源。该细胞中含有EBV，需要在二级生物安全柜中操作；可作转染宿主。

RAJI细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备1640（推荐iCell-0002）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于可溶性CD40配体对非霍奇金淋巴瘤Raji细胞的生物学作用研究

可溶性CD40配体（soluble CD40 ligand,sCD40L）对非霍奇金淋巴瘤Raji细胞增殖凋亡以及研究MAPK通路上信号因子RAS/RAF/MEK/ERK的影响,为sCD40L能否应用于人Burkitt淋巴瘤治疗提供更多的实验和理论依据。

方法:1.常规培养Raji细胞;取对数生长期的细胞以浓度梯度0.25μg/mL,0.5μg/mL,1μg/mL,2μg/mL,4μg/mL分别处理24h,48h,72h后,加入CCK8溶液检测细胞活力情况,确定细胞增殖的变化,以了解sCD40L对Raji细胞的相关生物学影响CCK-8法检测sCD40L对其的增殖的影响。

2. 采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测sCD40L对Raji细胞凋亡的影响;

3. 流式细胞术检测sCD40L对Raji细胞周期的影响;

4. 使用实时荧光定量PCR法检测反映sCD40L对Raji细胞中ras、raf、MEK、ERK1/2mRNA表达的影响。

结果:1.不同浓度sCD40L对Raji细胞作用24 h、48 h、72 h小时后均有不同程度的抑制作用,与对照组相比较,均有显著差异（P＜0.05）。本实验中以sCD40L的浓度为4μg/mL对Raji细胞抑制作用最明显;同一浓度、不同作用时间下,72 h抑制作用最明显。

2. AnnexinV-FITC/PI双染法显示,Raji细胞与浓度为4μg/mL的sCD40L作用24 h、48 h、72 h,Raji细胞的凋亡率逐渐增高,且72 h凋亡率最高,与24 h、48 h相比具有统计学意义（P﹤0.05）。提示sCD40L可诱导Raji细胞的凋亡,随着sCD40L作用时间延长,对Raji细胞凋亡率逐渐增高。

3. 流式细胞术检测细胞周期显示,用浓度为4μg/mL的sCD40L处理24h、48h后,Raji细胞G0/G1期的细胞比例增加,与S、G2/M相比有差异（P＜0.05）,提示可能细胞被阻滞在G0/G1期。

4. 实时荧光定量PCR检测结果显示,以浓度为4μg/mL的sCD40L与Raji细胞分别共育24 h、48 h、72 h后,ras mRNA在48 h、72 h表达量降低,后者与同时间对照组比较有差异（P＜0.05）;raf mRNA在72 h表达量降低,与同时间对照组比较无统计学意义（P（29）0.05）;MEK mRNA在48 h及表达量降低,与同时间对照组比较无统计学有差异（P（29）0.05）;ERK mRNA在72 h表达量降低,与同时间对照组比较有差异（（49）＜0.05）,但各基因在除上述时间以外的其他时间点表达量均高于相应对照组,统计学比较结果不一致。以上结果显示,随着时间变化,各基因表达结果存在差异但无规律性,因而暂时无法验证sCD40L作用Raji细胞后,不能确定是否与MAPK通路有关。

结论:1.sCD40L在体外可抑制Raji细胞增殖并促进其凋亡,本实验结果显示当sCD40L浓度为4ug/ml,作用时间在72 h时上述效果最明显。

2. sCD40L在体外将Raji细胞阻滞在G0/G1期。

3.sCD40L作用Raji细胞不同时间后的MAPK通路相关因子ras、raf、MEK、ERK mRNA表达量结果有一定差异,但尚不能说明是通过抑制MAPK通路有关。

参考文献

[1]Burkitt lymphoma in Iraqi children:A distinctive form of sporadic disease with high incidence of EBV＜sup＞+＜/sup＞cases and more frequent expression of MUM1/IRF4 protein in cases with head and neck presentation[J].Stefania Uccini,Mazin F.Al‐Jadiry,Claudia Cippitelli,Caterina Talerico,Stefania Scarpino,Amir F.Al‐Darraji,Safaa A.F.Al‐Badri,Adel R.Alsaadawi,Salma A.Al‐Hadad,Luigi Ruco.Pediatric Blood＆Cancer.2018(12)

[2]Burkitt Lymphoma-A Rare But Challenging Lymphoma[J].Carla Casulo,Jonathan Friedberg.Best Practice＆Research Clinical Haematology.2018

[3]Contribution of immunocytochemistry to the diagnosis of usual and unusual lymphoma cases[J].Dilip Das.Journal of Cytology.2018(3)

[4]Negative regulation of lens fiber cell differentiation by RTK antagonists Spry and Spred[J].Guannan Zhao,Charles G.Bailey,Yue Feng,John Rasko,Frank J.Lovicu.Experimental Eye Research.2018

[5]杨雨.可溶性CD40配体对非霍奇金淋巴瘤Raji细胞的生物学作用研究[D].遵义医科大学,2019.