JM109感受态细胞的应用

背景^[1-3]

JM109感受态细胞来源于E.coli K strain，是提取高质量DNA的理想菌株，recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。携带hsdR17基因型背景，使得异源DNA不被内源核酸酶系统降解。laqI qZΔM15的存在使JM109可用于构建克隆，蓝白斑筛选实验；High5TM系列JM109感受态细胞经特殊工艺制作，经pUC19质粒检测转化效率可达1×109cfu/μg。

JM109感受态细胞

JM109感受态细胞源自于JM109,它含有T7RNA聚合酶基因的染色体拷贝。如果克隆至载体上的基因包含了核糖体结合位点，JM109(DE3)就可以对位于T7启动子下游的基因序列进行高水平的表达。但是要注意的是JM109(DE3)不能用于蓝白斑实验，JM109(DE3)采用经常使用的LB培养基，在37℃有氧的条件下培养，然后使用20%甘油，在-80℃的条件下进行菌种保藏。JM109(DE3)转化质粒采用的是42℃热激处理的方法。

使用方法

1.取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。以下实验以50μl感受态细胞为例。

2.待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA（根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和），用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。

3.42℃热击90秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。

4.每个离心管中加入450μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟使菌体复苏。

5. 根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。

应用^[4][5]

用于OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白在肺癌中表达的定量研究及意义研究

建立用荧光定量RT—PCR法检测肺癌组织中人类有机阴离子转运多肽（organic anion transporting polypeptide,OATP）B和D mRNA的表达,并用免疫组化及图像分析技术定量分析肺癌组织中蛋白表达水平,分析其mRNA及蛋白表达与病理分型等临床资料的关系。

方法；1.荧光定量PCR标准曲线的建立及优化:（1）组织总RNA提取:用Tiozol试剂分别提取不同病理分型肺癌组织和正常肺组织中的总RNA。（2）cDNA的合成:以所提取的组织的总RNA为原料进行逆转录反应,获得cDNA。（3）PCR反应及重组质粒的构建:以逆转录的cDNA为模板,进行普通PCR扩增。扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶回收法进行纯化。用PGEM-T Easy质粒载体连接PCR纯化产物,构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞,蓝白斑筛选重组质粒。（4）标准曲线的建立及优化:优化荧光定量PCR体系和条件,以重组质粒为标准品建立检测OATP mRNA的标准曲线,并以此对40例肺癌标本中OATP-B和OATP-D mRNA的含量进行测定。

2. 免疫组化:采用链霉亲和素—过氧化酶法（S—P法）,DAB显色液显色,以抗OATP-B和抗OATP-D为一抗,PBS作为阴性对照,鉴定肺癌中OATP-B和OATP-D蛋白的表达。用IPP4.0图像分析软件对免疫组化结果进行分析。

3. 临床资料分析:结合临床资料,分析OATP-B和OATP-D的mRNA及蛋白表达与病理分型、性别、年龄、肿瘤大小以及有无淋巴结转移等的关系。

4. 统计学分析:采用SPSS11.5统计学软件包对所得实验数据进行统计学分析,实验数据均用（?）±S表示,多组均数间的比较采用方差分析,多组均数间的两两比较采用q检验。P＜0.05,差异有统计学意义。

结果：构建了OATP基因的重组质粒,并且成功转化大肠杆菌JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选提取重组质粒,对质粒进行梯度稀释,以稀释的质粒为模板优化荧光定量PCR体系和条件,建立定量检测OATP-B和OATP-D mRNA的荧光定量PCR体系。荧光定量PCR结果显示,OATP-B和OATP-D的mRNA在不同病理分型肺癌中表达上调,P＜0.05,差异有统计学意义;OATP-B和OATP-D的mRNA在有无淋巴结转移肺癌中的表达差异有统计学意义,P＜0.05。免疫组化法显示,与正常肺组织相比,OATP-B和OATP-D蛋白在不同病理分型肺癌中高表达,P＜0.05,差异有统计学意义;OATP-B和OATP-D蛋白在有淋巴结转移肺癌中的表达明显无高于淋巴结转移肺癌,P＜0.05,差异有统计学意义。OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白在不同病理分型、性别、年龄及不同大小肺癌标本间的表达无统计学差异,P＞0.05。

结论：1.建立并优化检测OATP-B和OATP-DmRNA表达的荧光定量PCR体系。

2.OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白在不同病理分型肺癌及淋巴结转移肺癌中均高表达;OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白的表达与肺癌标本的不同病理分型、性别、年龄及大小无关。提示OATP-B和OATP-D在肺癌的发生、发展中发挥了重要作用,一方面可能为肿瘤发生及药物治疗的分子机制提出新的理论,另一方面为其他肿瘤多种基因的大规模临床检测提供了迅速可靠的mRNA荧光定量方法。

参考文献

[1]Rapid identification of three functionally relevant polymorphisms in the OATP1B1 transporter gene using Pyrosequencing＆trade;[J].Maren Rohrbacher,Anja Kirchhof,Carsten Skarke,Gerd Geisslinger,J＆ouml,rn L＆ouml,tsch.Pharmacogenomics.2006(2)

[2]Effects of fibrates on human organic anion-transporting polypeptide 1B1-,multidrug resistance protein 2-and P-glycoprotein-mediated transport[J].M.Yamazaki,B.LI,S.W.Louie,N.T.Pudvah,R.Stocco,W.Wong,M.Abramovitz,A.Demartis,R.Laufer,J.H.Hochman,T.Prueksaritanont,J.H.Lin.Xenobiotica.2005(7)

[3]Suppression of Cell Proliferation by Inhibition of Estrone-3-Sulfate Transporter in Estrogen-Dependent Breast Cancer Cells[J].Takashi Nozawa,Masato Suzuki,Hikaru Yabuuchi,Masanori Irokawa,Akira Tsuji,Ikumi Tamai.Pharmaceutical Research.2005(10)

[4]pH-Dependent passive and active transport of acidic drugs across Caco-2 cell monolayers[J].Sibylle Neuhoff,Anna-Lena Ungell,Ismael Zamora,Per Artursson.European Journal of Pharmaceutical Sciences.2005(2)

[5]丁晓燕.OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白在肺癌中表达的定量研究及意义[D].山东大学,2009.