前列腺上皮细胞的应用

背景^[1-3]

前列腺上皮细胞提取于人正常前列腺组织。原代冻存。每管含有细胞数>5×105 cells/ml。此细胞通过应用细胞角蛋白（CK-14、18和19）抗体进行免疫荧光染色验证，经测试不含有HIV-1、H、BV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。细胞可以达到15倍增。

前列腺是雄性哺乳动物生殖系统一个重要附属器官，其结构和功能活动均受雄性激素的调控。前列腺由具有不同细胞角蛋白表达谱的三个带组成[1]。基底细胞主要表达高分子量细胞角蛋白（CK5和CK14），腔分泌细胞主要表达低分子量细胞角蛋白（CK8和CK18），而中间细胞则同时表达基底和管腔细胞角蛋白[2]。越来越多的证据表明，基底上皮细胞可分化成管腔上皮细胞。前列腺癌是影响老年男性的最常见癌症之一，而且是老年男性一个重要原因死亡。前列腺上皮细胞的培养为研究前列腺的许多重要特性以及化学和激素性致癌作用提供了独特的机会。

前列腺上皮细胞

细胞接收后的处理方法

1）收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染。

2）在显微镜下确认细胞生长状态时，在低倍镜（4或5X物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X和20×物镜下，同时给细胞拍照各2-3张（10×，20×都要拍照），作为售后的依据。

3）观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；马血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于前列腺上皮细胞及其表达CKIP-1对前列腺部尿道创面中成纤维细胞TGF-β1和α-SMA表达的影响研究

建立犬前列腺及膀胱颈切除动物模型,观察两创面修复过程及修复后期创面转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、酪蛋白激酶2相互作用蛋白1（Casein kinase 2 interaction protein 1,CKIP-1）表达;构建过表达CKIP-1的人前列腺上皮细胞（BPH-1细胞）,建立BPH-1细胞（或过表达CKIP-1的BPH-1细胞）与人成纤维细胞（HFF-1细胞）共培养细胞模型,观察过表达CKIP-1的BPH-1细胞TGF-β1表达,共培养下HFF-1细胞TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle acting,α-SMA）表达变化,以期为创面减少瘢痕愈合提供新的数据。

方法:（1）建立两微米（Two micron,2μm）激光犬前列腺及膀胱颈切除动物模型,分别于术后3天、1、2、3、4、8及12周留取前列腺部尿道及膀胱颈创面标本,序贯取材、苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色光镜下观察两创面修复病理组织学变化,免疫组化染色方法检测术后3、4、8及12周两创面TGF-β1、CKIP-1表达;

（2）构建过表达CKIP-1的BPH-1细胞,Western blot方法检测BPH-1细胞TGF-β1表达;分别建立BPH-1细胞与HFF-1细胞共培养（共培养组）、过表达CKIP-1的BPH-1细胞与HFF-1细胞共培养（过表达共培养组）细胞模型,培养72小时后,Western blot方法检测各组HFF-1细胞TGF-β1、α-SMA表达。

结果:（1）前列腺部尿道创面由创面下前列腺导管或腺泡内基底细胞增殖、迁移、发芽后覆盖创面后再分化完成再上皮化,修复完成后,创面内存在大量前列腺上皮,少量瘢痕形成;膀胱颈创面由创缘旁尿路上皮增殖、迁移并覆盖创面再分化完成再上皮化,修复完成后,创面内无上皮细胞,创面见较多瘢痕组织;

（3）前列腺部尿道创面,与术后3周相比,术后4、8及12周创面内前列腺上皮细胞及成纤维细胞（或纤维细胞）TGF-β1表达均降低（P＜0.01,P＜0.05）;与术后3周相比,术后4、8及12周创面内前列腺上皮细胞CKIP-1表达增加（P＜0.01）;膀胱颈创面,与术后3周相比,术后4、8及12周创面内成纤维细胞（或纤维细胞）TGF-β1表达无明显变化;术后4、8及12周,前列腺部尿道创面内成纤维细胞（或纤维细胞）TGF-β1表达较膀胱颈创面内成纤维细胞（或纤维细胞）TGF-β1表达降低（P＜0.01）;前列腺部尿道与膀胱颈创面内成纤维细胞（或纤维细胞）均微弱CKIP-1表达且术后3、4、8及12周均无明显改变;

（3）与对照组相比,过表达CKIP-1的BPH-1细胞组TGF-β1表达降低了25%（P＜0.05）;与对照组相比,共培养组HFF-1细胞TGF-β1、α-SMA表达分别降低了20%和30%（P＜0.05）,与共培养组相比,过表达共培养组HFF-1细胞TGF-β1、α-SMA表达分别降低了15%和10%（P＜0.05）。

结论:（1）前列腺部尿道创面内大量的前列腺上皮细胞可能是该创面少瘢痕愈合的原因之一;

（2）前列腺部尿道修复后期创面内前列腺上皮细胞可能通过上调CKIP-1表达降低了自身TGF-β1表达并抑制周围成纤维细胞TGF-β1的表达及向肌成纤维细胞转化,减少纤维细胞的过度增生及瘢痕的过度形成。

参考文献

[1]Silencing of CKIP-1 promotes tumor proliferation and cell adhesion-mediateddrug resistance via regulating AKT activity in non-Hodgkin’s lymphoma[J].Xinhua Zhu,Yu Ouyang,Fei Zhong,Qiru Wang,Linlin Ding,Peipei Zhang,Lingling Chen,Hong Liu,Song He.Oncology Reports.2017(1)

[2]Re-epithelialization resulted from prostate basal cells in canine prostatic urethra may represent the ideal healing method after two-micron laser resection of the prostate[J].Ying Cao,Guang-Heng Luo,Lei Luo,Xiu-Shu Yang,Jian-Xin Hu,Hua Shi,Ping Huang,Zhao-Lin Sun,Shu-Jie Xia.Asian Journal of Andrology.2015(5)

[3]Re:Prostatic Inflammation Enhances Basal-to-Luminal Differentiation and Accelerates Initiation of Prostate Cancer with a Basal Cell Origin[J].Anthony Atala.The Journal of Urology.2014

[4]Identification of UHRF1/2 as new N-methylpurine DNA glycosylase-interacting proteins[J].Chao Liang,Xueli Zhang,Shanshan Song,Chunyan Tian,Yuxin Yin,Guichun Xing,Fuchu He,Lingqiang Zhang.Biochemical and Biophysical Research Communicatio.2013(4)

[5]王礼鑫.前列腺上皮细胞及其表达CKIP-1对前列腺部尿道创面中成纤维细胞TGF-β_1和α-SMA表达的影响[D].贵州医科大学,2018.