人慢性髓原白血病细胞的应用

背景^[1-3]

人慢性髓原白血病细胞是由Lozzio从一名53岁的慢性髓细胞性白血病急变期的女性患者的胸水中分离建立的。该细胞曾被认为来源于粒系，处于高度未分化阶段；Anderson等人作了细胞膜特性的研究后，认为该细胞是红白血病细胞系。该细胞是对自然杀伤细胞高度敏感的体外靶标，故而被广泛应用于这方面的研究。K562的原始细胞是一种具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞。该细胞表达CD7（25%）。

人慢性髓原白血病细胞

慢性髓系白血病（CML），俗称慢粒，是一种骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，其实质为9号染色体上C-ABL原癌基因移位至22号染色体，即t（9；22）（q34；q11），并在分子水平上导致BCR-ABL融合基因形成，其编码的p210BCR-ABL蛋白具有极强的酪氨酸激酶活性，使一系列信号弹发发生持续性磷酸化，影响细胞的增值分化、凋亡及粘附，导致CML的发生。

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备1640（推荐iCell-0002）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于新型Hsp90抑制剂-SNX-2112治疗人慢性髓细胞白血病机制研究

以人慢性髓细胞白血病细胞系K562为细胞模型,采用MTT法、Annexin-v/PI荧光染色法、流式细胞技术和Western Blot等方法,检测SNX-2112对K562细胞增殖、凋亡及caspase家族蛋白质表达的影响,结果表明SNX-2112（0.05-10μM）可以抑制K562细胞的增殖(IC50=0.92μM)并诱导其凋亡（凋亡率为10.6±2.1-75.8±7.4%）。在0.1-10μM范围内SNX-2112可以引起caspase-3,9和PARP前体活化,具有剂量依赖性。

利用全基因组表达谱芯片对1μM SNX-2112作用48 h后K562细胞的全基因组cDNA表达进行了检测,G0分析发现229个基因（占检出基因的10.75%）与线粒体功能有关,尤以线粒体代谢相关基因显著（占62.51%）,这一结果也为SNX-2112引起线粒体功能损伤提供了依据。通过双向凝胶电泳,获得药物作用细胞的双向电泳图谱,MALDI TOF/TOF质谱仪对差异表达的蛋白质点进行鉴定证实了55个差异点,生物信息学方法将这些蛋白质按功能进行分类发现有7个差异点与线粒体功能相关。

最后进一步研究了SNX-2112诱导K562细胞凋亡的机制。结合检出的Caspase家族活化通路和转录组与蛋白质组学的研究结果我们推断SNX-2112通过线粒体损伤的内源性通路介导了K562细胞凋亡。JC-1染色实验和cyto-c释放的Western Blot检测证实了这一结论。蛋白质组学的研究中鉴定出的差异蛋白质CRKL和Grb2为我们揭示出线粒体功能损伤的上游信号部分来自于Akt信号转导通路,Western Blot和co-IP实验证明了这一点。

体内实验选用尾静脉接种K562细胞的NOD/SCID小鼠作为慢性髓细胞白血病模型。接种小鼠给予SNX-2112（6mg/kg,iv）处理,同时分别设立17-AAG和阴性对照组。观察各组小鼠存活时间、测定人慢性白血病表面抗原CD13,CD33。结果表明SNX-2112可以抑制小鼠体内白血病细胞增殖,延长其生存期。本研究证明SNX-2112具有潜在的体外、体内慢性白血病治疗活性,并探索了该化合物抗肿瘤的部分作用机制,为进一步开发具有自主知识产Hsp90抑制剂药物建立了理论基础。

参考文献

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[3]Limited antitumor-effect associated with toxicity of the experimental cytotoxic drug cyclopentenyl cytosine in NOD/scid mice with acute lymphoblastic leukemia[J].Kirsten J.M.Schimmel,Bart A.Nijmeijer,Marianke L.J.van Schie,J.H.Frederik Falkenburg,Henk-Jan Guchelaar.Leukemia Research.2007(11)

[4]IPI-504,a novel and soluble HSP-90 inhibitor,blocks the unfolded protein response in multiple myeloma cells[J].Jon Patterson,Vito J.Palombella,Christian Fritz,Emmanuel Normant.Cancer Chemotherapy and Pharmacology.2008(6)

[5]金琳.新型Hsp90抑制剂-SNX-2112治疗人慢性髓细胞白血病机制研究[D].暨南大学,2009.