人激肽释放酶1(KLK 1)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人激肽释放酶1(KLK 1)ELISA KIT用于测定血清、血浆及相关液体样本中人激肽释放酶1(KLK 1)的活性及含量。

实验原理:人激肽释放酶1(KLK 1)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人激肽释放酶1(KLK1)水平。用纯化的人激肽释放酶1(KLK1)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入激肽释放酶1(KLK1)，再与HRP标记的激肽释放酶1(KLK1)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的激肽释放酶1(KLK1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人激肽释放酶1(KLK1)浓度。

人激肽释放酶1(KLK 1)ELISA KIT

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）去除颗粒。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作程序

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔加待测样本50μL。

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于激肽释放酶-1过表达对年龄相关性血管改变的影响研究

组织激肽释放酶（KLK）是激肽激酶系统（KKS）中的重要一员,KLKs是个庞大的家族,主要对抑制各类癌症的进展有非常明显的作用。近年来有研究表明,KLKs对调节血管生成、降低血压和减轻心脏和肾功能障碍等起到了促进作用,其中KLK1也被发现在缺血后血运重建、减少心功能障碍等过程中发挥关键作用,但是KLK1对血管的年龄相关性改变的影响我们暂不清楚。

探讨人激肽释放酶1（hKLK1）在SD大鼠过表达能否延缓血管的年龄相关性改变,可能是通过哪些途径影响的。

方法:将野生型SD大鼠和激肽释放酶-1过表达的SD大鼠在SPF级别动物房条件下,分别饲养至3月龄、12月龄和24月龄。1.通过测量血压、心率比较各组大鼠的心血管功能;

2. 通过HE染色判断大鼠主动脉的变化,如管腔面积,血管壁厚度;通过天狼猩红染色评估各组大鼠血管纤维化的程度;通过茜素红染色评估大鼠血管壁Ga离子沉积的程度;

3. 通过western blot检测不同年龄组的过表达和野生型SD大鼠的主动脉,KLK1和B2R的表达量；

4. 通过western blot检测老化相关基因和信号分子的表达。

结果:野生型和过表达型SD大鼠在心率上无明显差异,但野生型大鼠的血压随年龄明显增高,过表达老年鼠明显抑制了这一现象;WT组大鼠和KLK1过表达大鼠在3个月的主动脉血管结构无差异,12个月及24个月时,WT大鼠明显表现出管壁变厚、管腔增大、血管钙化和纤维化明显,KLK1过表达大鼠虽然有同样趋势,但变化相较之下并不十分明显,且比同样月龄的野生型大鼠上述现象明显减轻。Wstern Blot显示随着年龄增加,P53,P21表达增加,S0D1,SOD2表达降低,但同样年龄的大鼠,KLK1过表达型的P53,P21表达明显少于野生型,SOD1,SOD2的表达则多于野生型。

结论:1.KLK1过表达显著减轻大鼠年龄相关性的血压增高2.KLK1过表达显著抑制主动脉血管的年龄性相关的结构变化（减少血管钙化、纤维化、管腔增大,血管壁增厚）3.KLK1过表达可通过减少氧化应激和DNA损伤。

参考文献

[1]DNA damage responses and p53 in the aging process[J].Hui-Ling Ou,Bjorn Schumacher.Blood.2018(5)

[2]Vascular aging:Molecular mechanisms and potential treatments for vascular rejuvenation[J].Panagiotis Mistriotis,Stelios T.Andreadis.Ageing Research Reviews.2017

[3]The DNA Damage Response in Neurons:Die by Apoptosis or Survive in a Senescence-Like State?[J].Edward Fielder,Thomas von Zglinicki,Diana Jurk.Journal of Alzheimer’s Disease.2017(s1)

[4]Selective Substrates and Inhibitors for Kallikrein-Related Peptidase 7（KLK7）Shed Light on KLK Proteolytic Activity in the Stratum Corneum[J].Simon J.de Veer,Laetitia Furio,Joakim E.Swedberg,Christopher A.Munro,Maria Brattsand,Judith A.Clements,Alain Hovnanian,Jonathan M.Harris.Journal of Investigative Dermatology.2017(2)

[5]唐颖.激肽释放酶-1过表达对年龄相关性血管改变的影响[D].华中科技大学,2019.