大鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

大鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)ELISA KIT用于测定血清、血浆及相关液体样本中大鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)的活性及含量。

原理：本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠8-OHdG单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的8-OHdG与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠8-OHdG，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，8-OHdG浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中8-OHdG浓度。

大鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)ELISA KIT

准备试剂与收集血样

1.收集标本：血清、血浆（EDTA、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。所有标本测定前用标本稀释液作1：20稀释（取10ul，加标本稀释液190ul,稀释20倍）。

2.标准品液配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成40ng/ml的溶液。设标准管8管，管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入40ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔中加入抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应8-OHdG含量，再乘上稀释倍数即可。

应用^[4][5]

用于西格列汀对糖尿病大鼠肾脏8-OHdG和SOD表达的影响研究

1、观察8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）和超氧化物歧化酶（SOD）在糖尿病大鼠肾脏病变时的表达情况。2、探讨西格列汀对糖尿病大鼠肾脏8-OHdG和SOD表达的影响。

方法：选用清洁级雄性SD大鼠65只，随机分为对照组（NC组，n=15）和造模组（n=50）。对照组予普通大鼠饲料喂养，造模组予高糖高脂饲料喂养4周，测量体重（BW）、空腹血糖（FBG）和空腹胰岛素（FINS）。造模组使用STZ30mg/kg腹腔注射，对照组注射等计量的缓冲液。72小时后连续3次测随机血糖≥16.7mmol/L者确定为糖尿病大鼠（3只死亡，1只造模不成功）。将造模成功的大鼠随机分为糖尿病未干预组（DM组，n=16），西格列汀1mg/（kg·d）干预组（Sita1组，n=15），西格列汀10mg/（kg·d）干预组（Sita2组，n=15）。DM组和NC组分别给予等量生理盐水灌胃，NC组继续予普通饲料喂养，余三组予高脂饲料喂养。于第14周末测体重，收集各组大鼠24小时尿液测尿蛋白和8-OHdG，心尖部取血测FBG、FINS、肾功能和SOD。肾组织石蜡切片，HE染色观察肾组织病理形态学改变，免疫组化法观察8-OHdG、SOD的表达。

结果：1、4周后，大鼠体重及血生化的比较：造模型组大鼠体重、血糖、空腹胰岛素水平及胰岛素抵抗指数比正常组增高（P＜0.05）

2、14周后，四组大鼠体重、空腹血糖和空腹胰岛素的水平比较：与NC组比较，DM组、Sita1组及Sita2组BW明显下降（P＜0.05），Sita1组、Sita2组及DM组三组之间BW无明显差异（P＞0.05）。与NC组比较，DM组、Sita1组及Sita2组FBG均明显升高，FINS明显下降（P＜0.05），Sita2组较Sita1组及DM组，FBG下降，FINS升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而DM组与Sita1组之间FBG和FINS差异无统计学意义（P＞0.05）。

3、四组大鼠尿素氮、血肌酐和24h尿蛋白水平比较：与NC组比较,DM、Sita1组及Sita2组BUN、SCr、24h尿蛋白升高（P＜0.05），与DM组相比，Sita1组及Sita2组BUN、SCr、24h尿蛋白降低（P＜0.05），Sita2组较Sita1组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

4、四组大鼠24h尿8-OHdG表达和血清SOD活性水平比较：与NC组比较，DM组、Sita1组及Sita2组24h尿8-OHdG明显升高，血清SOD活性明显降低（P＜0.05），与DM组相比，Sita1组及Sita2组24h尿8-OHdG明显降低，血清SOD活性明显升高（P＜0.05），Sita2组较Sita1组差异有统计学意义（P＜0.05）。

5、四组大鼠HE染色切片光镜下观察：NC组大鼠肾小球结构未见明显异常；DM组大鼠肾小球体积明显增大充血，球囊腔变窄粘连，肾小球基膜增厚，系膜基质增生明显，肾小管管壁增厚，管腔狭窄。Sita1组和Sita2组有不同程度的减轻，Sita2组减轻更明显。

6、四组大鼠免疫组化检测肾组织8-OHdG和SOD表达水平比较：与NC组相比，DM组、Sita1组和Sita2组大鼠肾组织的8-OHdG表达水平明显升高，SOD表达水平明显降低（P＜0.05）；与DM组相比，Sita1组和Sita2组大鼠肾组织的8-OHdG表达水平明显降低，SOD表达水平明显升高（P＜0.05）；与Sita1组相比较，Sita2组大鼠肾组织的表达变化更明显P＜0.05)。

结论1、糖尿病大鼠尿液和肾组织中的8-OHdG表达增加，血清SOD活性和肾组织SOD表达减少，提示氧化应激参与糖尿病肾脏病变的发生发展。

2、西格列汀可下调糖尿病大鼠肾组织8-OHdG的表达，上调SOD的表达，对糖尿病大鼠肾脏有一定的保护作用。

参考文献

[1]Reduction of circulating superoxide dismutase activity in type 2 diabetic patients with microalbuminuria and its modulation by telmisartan therapy.[J].Fujita Hiroki,Sakamoto Takuya,Komatsu Koga,Fujishima Hiromi,Morii Tsukasa,Narita Takuma,Takahashi Takamune,Yamada Yuichiro.Hypertension research:official journal of the Japanese Society of Hypertension.2011(12)

[2][Cardioprotective effects of glucagon-like peptide-1:preclinical and clinical data].[J].Avogaro Angelo.Giornale italiano di cardiologia（2006）.2011(12 S)

[3]Prevention of diabetic nephropathy in rats through enhanced renal antioxidative capacity by inhibition of the proteasome[J].Zhi-Feng Luo,Wei Qi,Bing Feng,Jiao Mu,Wei Zeng,Yan-Hong Guo,Qi Pang,Zi-Lin Ye,Li Liu,Fa-Huan Yuan.Life Sciences.2011(11)

[4]Protective effect of Icariin on the early stage of experimental diabetic nephropathy induced by streptozotocin via modulating transforming growth factorβ1 and type IV collagen expression in rats[J].Min-You Qi,Kai-Chen,Hao-Ran Liu,Yan-hui Su,Su-Qing Yu.Journal of Ethnopharmacology.2011(3)

[5]陈洋.西格列汀对糖尿病大鼠肾脏8-OHdG和SOD表达的影响[D].南华大学,2012.