人果糖1,6二磷酸醛缩酶(FDA)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人果糖1,6二磷酸醛缩酶(FDA)ELISA KIT用于测定血清、血浆及相关液体样本中人果糖1,6二磷酸醛缩酶(FDA)的活性及含量。

人果糖1,6二磷酸醛缩酶(FDA)ELISA KIT检测原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被样本抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的样本呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

果糖1,6二磷酸醛缩酶(FDA)

样品收集、处理及保存方法

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断与分析：

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的指标标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度,再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

应用^[4][5]

用于水杨酸（SA）诱导的黄瓜超敏反应相关基因的筛选和表达分析研究

研究试图通过不同浓度水杨酸来处理黄瓜叶片,在相同环境的条件下,选出SA处理黄瓜叶片发生超敏反应的最适宜浓度（10mM）,并以该浓度SA处理黄瓜叶片进行了如下实验:1.黄瓜PCD的鉴定:以四真叶龄的黄瓜幼苗作为实验材料,叶片上滴加10mM水杨酸（SA）进行诱导处理,采用ROS原位检测、Trypan blue染色、PI和FDA荧光染色及TUNEL（显色法和荧光法）检测,确定10mM SA诱导黄瓜发生了细胞程序性死亡（PCD）,并伴随着ROS的积累和H2O2产生;以四真叶龄的黄瓜幼苗作为实验材料,取叶片表皮细胞经0.2%MeJA处理后,采用TUNEL荧光法检测,确定0.2%MeJA可以诱导黄瓜叶片PCD。

2. SA诱导黄瓜差异表达基因的筛选:叶绿体是发生植物光合作用的重要细胞器,在植物防御反应和超敏反应（HR）进程中也起重要作用。因此,通过对1759个高通量测序技术获取的差异表达基因的注释和分析,筛选叶绿体中与超敏反应相关的基因49个,设计引物。以四真叶龄的黄瓜幼苗作为实验材料,叶片滴加10mM SA诱导处理,得到总RNA,反转录得到cDNA后,对49个基因进行RT-PCR验证,得到15个基因。确定这15个基因在发生PCD的细胞中差异表达。

3. SA诱导黄瓜叶绿体内超敏反应相关DEGs的表达分析:通过对15个基因进行半定量RT-PCR表达分析发现,15个基因在SA和MeJA中都表达,呈现相似的表达趋势,SA与MeJA在诱导黄瓜PCD的过程中可能存在信号交叉,并协同发挥作用。

通过实时荧光定量PCR分析叶绿体内DEGs的表达趋势,根据基因在SA处理下的不同的表达趋势,可以分为:（1）急剧下降趋势包括A2（甜菜碱脱氢酶）（2）先下降后上升趋势D6（原叶绿酸氧化还原酶）、F7（0-琥珀苯甲酸-辅酶A连接酶）、E6（α-葡聚糖-水二激酶1）（3）先上升后下降趋势:A6（叶绿素还原酶1）、E3（果糖1,6-二磷酸醛缩酶）、E8（丙二烯氧化物环化酶）、D1（6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶）、G3（胱硫醚β合成酶（CBS）蛋白）、C3（σ因子结合蛋白1）、A5（脱镁叶绿酸a单加氧酶）、E7（ATP-依赖锌金属蛋白酶）、B3（类囊体加工肽酶）、A4（钙敏感受体）、E4（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转运子）。

参考文献

[1]LESION SIMULATING DISEASE 1 and ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1 differentially regulate UV‐C‐induced photooxidative stress signalling and programmed cell death in A rabidopsis thaliana[J].WERONIKA WITUSZY?SKA,MAGDALENA SZECHY?SKA‐HEBDA,MIROS?AW SOBCZAK,ANNA RUSACZONEK,ANNA KOZ?OWSKA‐MAKULSKA,DAMIAN WITO?,STANIS?AW KARPI?SKI.Plant Cell Environ.2015(2)

[2]Possible effects of pathogen inoculation and salicylic acid pre-treatment on the biochemical changes and proline accumulation in green bean[J].Najmeh Ayoubi,Mohammad J.Soleimani.Archives of Phytopathology and Plant Protection.2015(3)

[3]A fructose-1,6-biphosphate aldolase gene from Camellia oleifera:molecular characterization and impact on salt stress tolerance[J].Yanling Zeng,Xiaofeng Tan,Lin Zhang,Hongxu Long,Baoming Wang,Ze Li,Zhen Yuan.Molecular Breeding.2015(1)

[4]RNAi-directed downregulation of betaine aldehyde dehydrogenase 1（OsBADH1）results in decreased stress tolerance and increased oxidative markers without affecting glycine betaine biosynthesis in rice（Oryza sativa）[J].Wei Tang,Jiaqi Sun,Jia Liu,Fangfang Liu,Jun Yan,Xiaojun Gou,Bao-Rong Lu,Yongsheng Liu.Plant Molecular Biology.2014(4-5)

[5]刘双.水杨酸（SA）诱导的黄瓜超敏反应相关基因的筛选和表达分析[D].哈尔滨师范大学,2016.