大鼠性激素结合球蛋白(SHBG)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠性激素结合球蛋白(SHBG)ELISA试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中大鼠性激素结合球蛋白(SHBG)活性及含量。

实验原理:大鼠性激素结合球蛋白(SHBG)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠性激素结合球蛋白(SHBG)水平。用纯化的大鼠性激素结合球蛋白(SHBG)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酸化蛋白激酶C，再与HRP标记的磷酸化蛋白激酶C抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷酸化蛋白激酶C呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠性激素结合球蛋白(SHBG)活性浓度。

大鼠性激素结合球蛋白(SHBG)ELISA试剂盒

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）去除颗粒。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作程序

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔加待测样本50μL。

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于CRISPR/Cas9系统介导SHBG敲除大鼠的构建、繁育及鉴定研究

应用CRISPR/Cas技术成功构建SHBG基因敲除大鼠模型并在DNA及蛋白水平上证实了SHBG敲除的可靠性。随后,通过对不同基因型大鼠体重、脏器重量、血常规、血生化、性激素指标以及生殖能力的检测,了解SHBG基因敲除大鼠的生长发育及生殖状态,为阐述SHBG在性激素水平调节、生殖行为调控以及肿瘤发生发展中的作用机制提供稳定的动物模型。高通量测序实验筛选得到165个纯合子与野生型大鼠组之间的差异表达基因,进一步的加权共表达基因网络分析（WGCNA）识别到了4个与性激素水平及SHBG表达显著相关的基因（LOC108348081,STXBP5L、CLEC2DL1、SNORD26）,结果表明这些基因可能与SHBG协同调控体内性激素水平,为后续研究SHBG参与调控性激素水平的具体机制提供新的思路和方向。

材料和方法1 SHBG基因敲除大鼠模型的建立

1.1实验大鼠均选取F344品系大鼠,购自于北京唯尚立德生物科技有限公司。通过NCBI Genebank分析大鼠SHBG基因结构。根据SHBG基因组结构和蛋白功能保守区,结合基因敲除的基本原理,利用在线靶点预测网址:http://cri spor.tefor.net/来预测合适的敲除位点。

1.2利用预测工具获得4个gRNA靶点,利用试剂盒体外转录待选gRNA,随后准备需要酶切的dsDNA,以SHBG的基因组DNA为模板,将带有gRNA靶点的DNA片段利用PCR技术扩增出来,随后琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。通过比较活性来选择最适宜的gRNA靶点。

1.3首先取一结扎公鼠和一成熟雌鼠同笼,若在雌鼠阴道口检出黄白色栓,则雌鼠为假孕状态。然后取适龄雌鼠进行超数排卵处理,采集卵母细胞后进行体外受精获得受精卵。将gRNA和Cas9 mRNA混合后用显微注射装置将混合液导入受精卵胞浆中。选取优质的受精卵移入假孕母鼠的输卵管伞部开口处。对出生的大鼠进行基因型测序和鉴定分析,最后鉴定得到F0代SHBG+/-首建大鼠。

1.4利用CRISPR靶点设计在线网站（http://crispor.tefor.net/crispor.py）预测脱靶位点,选取评分靠前的四个潜在脱靶位点进行验证。根据脱靶位点上的基因序列设计引物进行PCR,随后对PCR产物进行高通量测序验证脱靶情况。

2 SHBG基因敲除大鼠的鉴定与繁育首先使F0代SHBG+/-大鼠与野生型F344大鼠合笼交配,得到F1代大鼠,剪趾编号后提取DNA进行基因型鉴定,筛选出SHBG+/-大鼠饲养至性成熟以后使其自交扩充繁殖体系,待新生鼠出生后剪趾鉴定,得到SHBG-/-,SHBG+/-和SHBG WT三种F2代基因型大鼠。

3 SHBG基因敲除大鼠肝脏及血液中SHBG蛋白的表达提取3系和10系F2代出生大鼠各9只来进行验证,其中杂合子、纯合子和野生型各三只,取大鼠肝脏组织,同时留取血液,提取总蛋白后利用Western blot实验和方法检测SHBG蛋白的表达。

参考文献

[1]Integrated Analysis of a Risk Score System Predicting Prognosis and a ceRNA Network for Differentially Expressed lncRNAs in Multiple Myeloma.[J].Zhou Sijie,Fang Jiuyuan,Sun Yan,Li Huixiang.Frontiers in genetics.2020

[2]An Emerging Class of Long Non-coding RNA With Oncogenic Role Arises From the snoRNA Host Genes.[J].Zimta Alina-Andreea,Tigu Adrian Bogdan,Braicu Cornelia,Stefan Cristina,Ionescu Calin,Berindan-Neagoe Ioana.Frontiers in oncology.2020

[3]Sex hormone-binding globulin and polycystic ovary syndrome[J].Jing-ling Zhu,Zhuo Chen,Wen-jie Feng,Shuang-lian Long,Zhong-Cheng Mo.Clinica Chimica Acta.2019(C)

[4]Sex Hormone Binding Globulin:A Review of its Interactions With Testosterone and Age,and its Impact on Mortality in Men With Type 2 Diabetes[J].Sudarshan Ramachandran,Geoffrey I.Hackett,Richard C.Strange.Sexual Medicine Reviews.2019(4)

[5]方久远.CRISPR/Cas9系统介导SHBG敲除大鼠的构建、繁育及鉴定[D].郑州大学,2021.