工程大肠杆菌生产L-酪氨酸

研究背景：

L-酪氨酸在医药和化学领域应用广泛。L-酪氨酸是许多重要次级代谢产物的前体，也是帕金森氏病药物3,4-二羟基-L-苯丙氨酸（L-DOPA）的重要前体。由于其生物合成途径长，调控复杂，利用微生物生产L-酪氨酸仍面临诸多挑战。

摘要：

之前关于L-酪氨酸过量合成的研究报道，最多见失活其转录调节子（由tyrR编码），及解除两个关键基因（aroG、tyrA）的反馈抑制。本研究通过实验提出了新的观点，tyrR基因的失活对L-酪氨酸的过量合成并不是必须的，而合适的补料策略，及内运蛋白（由tyrP编码）的失活，对过量合成L-酪氨酸则更为有效。

图1：大肠杆菌中L-酪氨酸生物合成途径

文章脉络：

（1）aroGfbr和tyrAfbr单基因过表达对酪氨酸产量的影响

分别以大肠杆菌BL21(DE3)和tyrR敲除菌株为出发菌，利用两种不同表达水平质粒单独过表达aroGfbr和tyrAfbr。摇瓶测定发现，在L-酪氨酸生产中aroGfbr过表达较tyrAfbr更有效。但菌株BTY1.1的代谢通量分布不理想，产生了大量的副产物L-苯丙氨酸。

（2）aroGfbr与tyrAfbr，aroL或aroK两基因过表达对酪氨酸产量影响

在野生型与tyrR敲除菌株中，aroGfbr分别与tyrAfbr，aroL，aroK，aroBopt或aroE过表达。发现在本研究表达系统，aroGfbr与aroL组合，推测aroL编码酶催化的莽草酸转化为莽草酸磷酸酯，是本表达系统的限速步骤。但过表达组合均未达到单独过表达aroGfbr的L-酪氨酸产量。

（3）aroGfbr、aroL与tyrAfbr或tyrC三基因过表达对酪氨酸产量的影响

在野生型与tyrR敲除菌株中，分别利用双载体系统与单载体系统检测aroGfbr，aroL和tyrAfbr或tyrC过表达效果。发现单载体表达系统效果较好，tyrC无论在何种表达体统，对于L-酪氨酸的产生都比tyrAfbr更有效。（注：tyrC为运动假单胞菌来源，具有与tyrA相似的功能，但tyrC对L-酪氨酸不敏感。）

（4）删除酪氨酸特异性和芳香族氨基酸转运蛋白对酪氨酸产量的影响

在野生型与tyrR敲除菌株中，依次进行tyrP（L-酪氨酸特异性转运蛋白）敲除、aroP（芳香族氨基酸转运蛋白）、tyrP和aroP双敲除，并导入单载体三基因表达系统。发现高产L-酪氨酸的三种菌株（BTY5.13，BTY2.13和BTY7.13）均失活了tyrP，表明失活tyrP有助于改善L-酪氨酸生产。

（5）补料分批发酵

在5L生物反应器中分别采用Exponential-to-DO-stat和DO-stat补料策略测定四种改造菌。菌株BTY2.13，其采用Exponential-to-DO-stat补料策略发酵，L-酪氨酸产量可达43.14g/ L，转化率达0.107g /g。

 表1：不同补料策略下改造菌的生长及产物合成情况

结论：

tyrR基因失活对于L-酪氨酸生产不是必需性的，而较优的载体系统和补料策略，以及内运蛋白tyrP的失活，对L-酪氨酸过量合成更为有效。

DO-stat补料模式下，tyrR未失活菌的乙酸较多，说明其代谢发生溢流，其机理仍需进一步研究和探索。