人一氧化碳血红蛋白(HBCO)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人一氧化碳血红蛋白(HBCO)ELISA试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中人一氧化碳血红蛋白(HBCO)活性及含量。

实验原理：人一氧化碳血红蛋白(HbCO)elisa试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被人一氧化碳血红蛋白(HbCO)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人一氧化碳血红蛋白(HbCO)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人一氧化碳血红蛋白(HBCO)ELISA试剂盒

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照随货说明书中图表在小试管中进行稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于一氧化碳饱和聚合血红蛋白（CO-PolyPHb）减轻高原低氧环境暴露小鼠心脏损伤研究

研究一氧化碳饱和聚合血红蛋白对模拟高原低氧环境下小鼠心脏功能障碍和心肌损伤的保护作用,并进一步探讨其保护作用是否与抑制TREM-1/TLR4,减轻炎症和凋亡有关。

方法:将C57BL/6小鼠随机分为常氧+生理盐水（NS）组、低氧+生理盐水（HS）组、低氧+CO-Poly PHb（HC）组,每组各10只。利用低压低氧动物实验舱模拟海拔5500米的高原低氧环境,实验舱运行时间为24小时/天,控制昼夜比为12小时:12小时。HS组和HC组置于低氧舱连续低氧处理7天,NS组持续置于常压常氧环境下饲养。在建模过程中,HC组小鼠在前3天连续经尾静脉给予0.3g Hb/kg/day CO-Poly PHb处理,NS组和HS组则经尾静脉给予等量生理盐水处理。采用超声心动图观察小鼠心脏结构和功能。测定血清心肌酶含量观察心肌损伤程度。苏木精伊红（HE）染色观察心肌组织病理学改变。实时荧光定量核酸扩增检测（RTFQ-PCR）法和酶联免疫吸附（ELISA）实验检测小鼠心肌和血清中白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量。蛋白免疫印迹（Western Blot）实验测定缺氧诱导因子1α（hypoxia-induced factor 1α,HIF-1α）、Bcl-2、Bax髓源细胞表面触发受体1（TREM-1）和toll样受体4（TLR4）蛋白在心肌组织的表达情况。

结果:1一氧化碳饱和聚合血红蛋白对高原低氧环境小鼠心脏的整体影响与常氧生活的小鼠对比,低氧处理小鼠左心室射血分数（ejection fraction of left ventricle,LVEF）和左心室短轴缩短率（fractional shortening of left ventricle,LVFS）明显降低（P＜0.01）,左心室收缩末期内径（end-systolic diamension of left ventricle,LVIDs）明显增高（P＜0.01）。此外,与常氧组相比,低氧还导致小鼠心脏肥厚,心脏重量与体重之比（heart weight/body weight,HW/BW）增高（P＜0.05）。与HS组相比,HC组小鼠心脏LVEF和LVFS增高,HW/BW值和LVIDs下降,差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。

2一氧化碳饱和聚合血红蛋白对高原低氧环境小鼠心肌酶的影响血清生化实验发现,与NS组相比,HS组小鼠血清的心肌损伤标记物肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase-MB,CK-MB）以及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）含量明显增加（P＜0.01）。与HS组相比,HC组小鼠血清CK-MB和LDH含量均明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.01）。

3一氧化碳饱和聚合血红蛋白对高原低氧环境小鼠心肌组织结构的影响HE染色实验发现,与NS组相比,HC组小鼠心肌组织在低氧暴露后出现心肌细胞水肿、核坏死,灶状变性并伴有炎性细胞浸润等病理性损伤。与HS组相比,HC组小鼠心肌细胞排列较为整齐,细胞水肿减轻,炎性细胞减少。

4一氧化碳饱和聚合血红蛋白对高原低氧环境小鼠心肌组织和血清炎性因子表达的影响荧光定量PCR实验发现,与NS组相比,低氧导致HS组小鼠白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）在心肌组织的表达量明显增加（P＜0.01或P＜0.05）。与HS组相比,HC组小鼠心肌组织IL-1β、TNF-α表达量降低,差异具有统计学意义（P＜0.01）。ELISA实验发现类似结果,与NS组相比,炎性因子白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和肿瘤坏死因-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）在HS组小鼠血清中的含量增高（P＜0.01）。与HS组相比,HC组小鼠血清中IL-1β、TNF-α含量降低,差异具有统计学意义（P＜0.01）。

参考文献

[1]A Brief History of Carbon Monoxide and Its Therapeutic Origins[J].Hopper Christopher P.,Zambrana Paige N.,Goebel Ulrich,Wollborn Jakob.Nitric Oxide.2021(prep)

[2]Carbon monoxide-saturated polymerized placenta hemoglobin optimizes mitochondrial function and protects heart against ischemia-reperfusion injury[J].Zhang Yarong,Nie Hongfei,Li Shen,Deng Yan,Zhou Wentao,Wu Wei,Xu Xuewen,Yu Haiyang,Li Tao.Journal of Cardiovascular Pharmacology.2021

[3]ABT-263 enhanced bacterial phagocytosis of macrophages in aged mouse through Beclin-1-dependent autophagy[J].Zhang Yu,Tang Li hua,Lu Jia,Xu Li ming,Cheng Bao li,Xiong Jun yu.BMC Geriatrics.2021(1)

[4]Tsantan Sumtang Restored Right Ventricular Function in Chronic Hypoxia-Induced Pulmonary Hypertension Rats[J].Yang Zhanting,Sun Haixia,Su Shanshan,Nan Xingmei,Li Ke,Jin Xueqin,Jin Guoen,Li Zhanqiang,Lu Dianxiang.Frontiers in Pharmacology.2021

[5]刘汉林.一氧化碳饱和聚合血红蛋白（CO-PolyPHb）减轻高原低氧环境暴露小鼠心脏损伤[D].西南医科大学,2022.