大鼠双氢睾酮(DHT)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠双氢睾酮(DHT)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中大鼠双氢睾酮（DHT）的含量。

实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠双氢睾酮（DHT）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠双氢睾酮（DHT）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠双氢睾酮(DHT)ELISA试剂盒

样本处理及要求：

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2．设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

3．样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5．弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于双氢睾酮对大鼠卵泡颗粒细胞和小鼠卵巢抗苗勒管激素表达以及原始卵泡发育的影响研究

探究双氢睾酮（dihydrotestosterone,DHT）对原代培养的大鼠卵泡颗粒细胞（granulosa cells,GCs）抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone,AMH）表达以及小鼠卵巢原始卵泡体外发育、AMH表达的影响。

方法1.部分实验:从21d SD雌性大鼠卵巢中提取卵泡GCs原代培养48h,先用HE染色检测GCs形态、卵泡刺激素受体（follicle-stimulating hormone receptor,FSHR）细胞免疫荧光检测GCs纯度;然后根据分组即对照组（无试剂干预）、10-5 mol/L DHT组、10-8 mol/L DHT组、2×10-5 mol/L蛋白激酶B（AKT）抑制剂（MK-2206 2Hcl）组和10-8 mol/L DHT+2×10-5 mol/L MK-2206 2Hcl组,分别使用相应浓度的试剂再干预GCs3h;干预完成后,细胞免疫荧光染色观察AMH表达的部位和变化。Western blot测定各组AMH、p-AKT蛋白表达量。

2. 第二部分实验:3d的ICR小鼠卵巢取出后根据分组即对照组（无试剂干预）、10-8 mol/L DHT组、2×10-5 mol/L MK-2206 2Hcl组和10-8 mol/L DHT+2×10-5 mol/L MK-2206 2Hcl组,分别使用相应浓度的试剂干预4d;HE染色后计数各组原始卵泡、早期生长卵泡在整个卵巢中的个数;免疫组化检测各组小鼠卵巢PCNA、AMH的表达;Western blot检测各组小鼠卵巢AKT信号通路相关因子（AKT、FoxO3a、PTEN）、AMH以及PCNA蛋白表达的变化。HE染色、免疫组化以及Western blot比较3d组和7d组小鼠卵巢原始卵泡、早期生长卵泡在整个卵巢中的个数、PCNA以及AMH等指标的变化。

结果1.部分实验:AMH主要表达在大鼠卵泡GCs的细胞膜和细胞质中;与对照组比较,10-8 mol/L DHT和10-5 mol/L DHT均使GCs AMH表达增加（P＜0.05）,两种浓度DHT对GCs AMH表达的影响无统计学差异（P＞0.05）;与对照组比较,10-8 mol/L DHT使GCs的p-AKT、AMH表达升高（P＜0.05）,2×10-5 mol/L MK-2206 2Hcl使GCs的AMH表达降低（P＜0.05）;与MK-2206 2Hcl处理组比较,DHT+MK-2206 2Hcl处理组AMH表达升高（P＜0.05）。

3. 第二部分实验:AMH主要表达在小鼠卵巢早期生长卵泡的颗粒细胞上,在原始卵泡上表达较少;经过DHT处理,小鼠卵巢生长卵泡数量、生长卵泡占总卵泡数的比例、PCNA、AMH、p-AKT、p-FoxO3a的表达升高（P＜0.05）,PTEN的差异无统计学意义（P＞0.05）;经过MK-2206 2Hcl的处理,小鼠卵巢早期生长卵泡数量、早期生长卵泡占总卵泡数的比例、PCNA、AMH、p-AKT表达降低（P＜0.05）;与MK-2206 2Hcl处理组比较,DHT+MK-2206 2Hcl处理组小鼠卵巢早期生长卵泡数量、早期生长卵泡占总卵泡数的比例、PCNA、AMH表达升高（P＜0.05）;7d组小鼠卵巢早期生长卵泡数量、早期生长卵泡占总卵泡数的比例、PCNA以及AMH表达量均高于3d组（P＜0.05）。

结论DHT不仅可以上调大鼠卵泡GCs和小鼠卵巢AMH的表达,还可以启动小鼠原始卵泡发育,且这些作用可能与激活AKT信号通路有关。

参考文献

[1]Hippo pathway functions as a downstream effector of AKT signaling to regulate the activation of primordial follicles in mice[J].Liao‐Liao Hu,Tie Su,Rui‐Chen Luo,Yue‐Hui Zheng,Jian Huang,Zhi‐Sheng Zhong,Jing Nie,Li‐Ping Zheng.Journal of Cellular Physiology.2019(2)

[2]Polycystic ovary syndrome（PCOS）and kisspeptin–A Sri Lankan study[J].B Umayal,S Jayakody,N Chandrasekharan,W Wijesundera,C Wijeyaratne.Journal of Postgraduate Medicine.2019(1)

[3]Treatment with the synthetic PPARG ligand pioglitazone ameliorates early ovarian alterations induced by dehydroepiandrosterone in prepubertal rats[J].Leandro M.Velez,Giselle A.Abruzzese,María F.Heber,Silvana R.Ferreira,Alicia B.Motta.Pharmacological Reports.2018

[4]Polycystic ovary syndrome（PCOS）,an inflammatory,systemic,lifestyle endocrinopathy[J].Seema Patel.Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Bio.2018

[5]王美玲.双氢睾酮对大鼠卵泡颗粒细胞和小鼠卵巢抗苗勒管激素表达以及原始卵泡发育的影响[D].宁夏医科大学,2020.