人抗网硬蛋白抗体(ARA)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗网硬蛋白抗体(ARA)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人抗网硬蛋白抗体(ARA)的含量。

实验原理：人抗网硬蛋白抗体(ARA)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人抗网硬蛋白抗体(ARA)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗网硬蛋白抗体(ARA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人抗网硬蛋白抗体(ARA)ELISA试剂盒

样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操纵步骤：

1.包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释,一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。

2.洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板颠倒在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

3.加封闭液200微升，37℃放置一小时。

4.洗涤同2。

5.加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。

6.洗涤同2。

7.加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,每孔200微升,放置37℃1小时。

8.洗涤同2。

9.加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。

10.加终止液：每孔50微升。

11.观察结果：用酶联免疫检测仪记录450nm读数。

应用^[4][5]

用于HepPar-1及CD34在肝细胞肝癌病理诊断中的应用及临床意义研究

细胞学特征也能帮助鉴别分化良好的HCC和良性肝组织。这些细胞结构特征可以诊断大部分H＆E染色的HCC细胞切片,有些时候需要广泛使用的组织化学染色的帮助,特别是网硬蛋白染色和黏蛋白卡红染色。然而,分化非常好和分化极差的HCC的诊断可能需要免疫组化标记的帮助。多项研究认为HCC的—线抗体由HepPar-1和CD34组成,故我此次选取这两种免疫组化分子标记物,HepPar-1和CD34,探讨其在原发性肝癌不同病理类型中的表达情况及与HCC临床病理特征之间的关系,为更好地诊断HCC提供帮助。

研究方法1.收集手术治疗的HCC标本312例,所有标本在离体2小时内均用中性甲醛固定或先用冰盒冷藏再迅速转移至低温冰箱保存。所有组织标本均行石蜡切片,肝癌的病理学诊断均经两名病理学家在随机双盲的情况下检查证实确定。

2. 收集312例HCC标本的临床和病理特征参数。

3. 采用免疫组化技术检测312例HCC患者肿瘤组织中HepPar-1和CD34的表达情况,并综合其它研究结果分析HepPar-1和CD34在不同类型的原发性肝癌中的表达情况。

4. 统计学处理:所有数据均采用SPSS18.0软件进行统计分析。用（x±s）形式表达计量资料,运用连续矫正的卡方检验和fisher精确检验探讨CD34与临床病理参数之间的关系;采用卡方检验研究HepPar-1和临床病理参数之间的关系。用多因素logistic回归验证临床病理参数与HepPar-1是否有关。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果和意义1.HepPar-1在HCC中的阳性率为85.26%其阳性率在高级别肿瘤中最低;HepPar-1的表达在分化程度方面存在差异（P＜0.05）,而在性别,年龄,肿瘤径方面均无差异（P＞0.05）;

2. HCC中CD34的阳性率为98.4%;CD34的阳性率与肿瘤分化程度,性别,年龄,肿瘤径无明显相关性（P＞0.05）;

3.CD34及HepPar-1在HCC中均为阳性的概率为83.65%;均为阴性的概率为0.32%。HepPar-1的阳性率越低,HCC分化程度越差,癌细胞的增殖活性越强;而HepPar-1的阳性率在性别,年龄,肿瘤径方面均无明显差异。

参考文献

[1]Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].Freddie Bray BSc,MSc,PhD,Jacques Ferlay ME,Isabelle Soerjomataram MD,MSc,PhD,Rebecca L.Siegel MPH,Lindsey A.Torre MSPH,Ahmedin Jemal PhD,DVM.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2018(6)

[2]Diagnostic role of glypican 3 and CD34 for differentiating hepatocellular carcinoma from nonmalignant hepatocellular lesions[J].Eman Tawfik Enan,Amira Kamal El-Hawary,Dina Abd El-Aziz El-Tantawy,Maha Mohamed Abu-Hashim,Nagwa Mokhtar Helal.Annals of Diagnostic Pathology.2013(6)

[3]Sarcomatous dermatofibrosarcoma protuberans metastasized to the lung:Preservation of CD34 expression in tumor cells[J].NorikoOhtani,ToshioFukusato,FumiakiTezuka.Pathology International.2008(12)

[4]Distinction of Hepatocellular Carcinoma From Benign Hepatic Mimickers Using Glypican-3 and CD34 Immunohistochemistry[J].Wanda M.P.Coston,Sofia Loera,Sean K.Lau,Shin Ishizawa,Zhong Jiang,Chin-Lee Wu,Yun Yen,Lawrence M.Weiss,Peiguo G.Chu.The American Journal of Surgical Pathology.2008(3)

[5]费晓玥.HepPar-1及CD34在肝细胞肝癌病理诊断中的应用及临床意义[D].山东大学,2020.