人血清白蛋白的检测试剂及定量检测方法

背景技术

人血白蛋白（human serum albumin，HSA)是一种小分子量、非糖基化、带负电荷的 血清蛋白，具有物质结合、运输、抗氧化以及酶活性等多种功能。生理情况下，白蛋白是 细胞外液中含量最多的蛋白质，其中血浆白蛋白含量为35~50g/L，约占血浆总蛋白的60%， 远高于组织间液中的蛋白含量。白蛋白主要在肝脏合成，但不在肝脏内贮存，由肝细胞直接 分泌到窦状隙中进入血液循环，半衰期为17~19d，最终由肌肉、肝脏和肾脏等降解。

HSA是一种包含有585个氨基酸的小分子球状蛋白质，有少量色氨酸和蛋氨酸残基 及大量的带电荷的赖氨酸、天门冬氨酸残基，没有非朊基团和糖，分子量为eekDd线晶体照 相显示其拥有一个心形的三维结构，但在溶液中呈椭圆体。HSA由3个相似的结构域(I 一 m) 组成，每个结构域包含2个亚级结构(A和B)，分别由4个和6个α螺旋组成，结构域间的二硫键 和亚级结构间通过脯氨酸残基提供的灵活环结构做相对移动以助于白蛋白结合各种物质。 生理情况下，HSA主要以带一个自由硫氢基的还原形式存在(HSA-SH)，也称硫基白蛋白。半 胱氨酸-34的硫氢基部分有助于硫醇化作用和亚硝基化进程，这与HSA在体内的多种作用有 关。小部分HSA以二硫化物形式存在，且含量随年龄增长而增高，在氧化应激等疾病状态时 也会增高。

HSA可结合多种内源性和外源性化合物，包括脂肪酸、金属离子、药物、代谢产物 等，提示其具有药物转运功能。HSA结合位点I和Π 位于不同的结构域，负责结合与蛋白质作 用的大多数药物，其中位点I除了可结合较大的杂环化合物或二羧基酸，以及其他多种化合 物外，还可以结合体积庞大的内源性物质，如胆红素、扑啉等，位点Π 则较小且欠灵活，结合 功能更为特异。半胱氨酸-34可结合顺铂、青霉胺、Ν-乙酰半胱氨酸等药物。一氧化氮(Ν0)也 可通过亲电子与半胱氨酸-34结合形成S-亚硝基白蛋白，产生扩血管作用，但生理状况下， 血浆中S-亚硝基白蛋白含量极低（〈10 nmol/L)，目前还不清楚病理状况下HSA能在多大程 度上结合N0及其衍生物。此外，还有一些药物和化合物不能确定具体的结合位点。

HSA具有协调维持血管内皮完整性，抗氧化作用，脏器功能保护，维持胶体渗透压， HSA还有保护血细胞、调节凝血、作为氮源为损伤组织修复提供营养等作用。因此，开发检测 迅速，操作简单，成本低廉的HSA检测方法具有重要意义。

本发明提供了一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用，具体为HCAB可 与白蛋白特异性结合，抑制了扭曲分子内电荷转移现象，非辐射跃迀减少，从而恢复荧光， 实现白蛋白的定量检测。在生理pH值条件下被激发后(激发波长λ Μ= 424 nm)产生稳定的 荧光信号(发射波长λ_= 560 nm)。其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧 光值可推算出生物样品中白蛋白的含量。该方法可用于测定血浆、尿液等多种生物样品中 白蛋白的绝对含量，同时还具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测 的优势，并且操作简单，成本低廉。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

探针1、2或HCAB的合成

探针1的合成： 1 · 3mmol的化合物3 (2 ' -羟基苯乙酮）、1 · 2mmol的化合物4(4-二甲氨基苯甲醛)溶解在 30mL乙醇中，再向其中滴加4.9mmol氢氧化钾溶液。搅拌8 h，旋蒸除去溶剂，将剩余固体纯 化(硅胶、乙酸乙酯-正己烷作为洗脱剂，1: 5，v/v)，得到红色固体160mg，为探针1，产率为 50%。探针 1 的 1HNMR (400 MHz,CDC13): δ 13.19 (s，1H)，7.91 (d，J = 7.0 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.37-7.49 (m, 2H), 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.85-6.96 (m, 1H), 6.69 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 3.05 (s, 6H)。

探针HCAB的合成： 将0 · 5mmol的探针1和0 · 5mmol的三乙胺加入到10mL的四氢呋喃中，再将苯甲酰氯(0.6 mmol，混合5mL四氢呋喃)在30分钟内逐滴加入反应混合物中，在0°C下搅拌lh，然后升温至 室温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，剩余固体纯化(硅胶、乙酸乙酯-正己烷作为洗脱剂，l:3，v/ v)，得到103 mg的黄色固体，为探针HCAB，产率为55%。探针HCAB的1H NMR (400 MHz, CDC13)： δ 8.13 (d, J = 1.2 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.54 (m, 3H), 7.35 (m, 6H), 6.94 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 6.58-6.60 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 3.01 (s, 6H); 13CNMR (100 MHz, CDCI3): 191.84， 165.02， 152.06， 148.63， 146.91， 133.51, 133.42, 131.65, 130.42, 130.31, 129.80, 129.29, 128.49, 125.95, 123.40, 122.25, 120.71, 111.71, 40.99; HRMS: m/z calcd for C24H21NO3： 371.1521 and found 371.1522。

探针2的合成： 将0.5mmol的探针1和0.5mmol的三乙胺加入到10mL的四氢呋喃中，再将乙酰氯（0.6 mmol，混合5mL四氢呋喃)在30分钟内逐滴加入反应混合物中，在0°C下搅拌lh，然后升温至 室温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，剩余固体纯化(硅胶、乙酸乙酯-正己烷作为洗脱剂，1:3，v/ v)，得到82mg的黄色固体为探针2,产率为53%。探针2的1H NMR (400 MHz, CDCI3): δ 7.66 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.42-7.56 (m,4H), 7.32 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.15 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 3.03 (s, 6H), 2.22 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCh): 191.85，169.44， 152.15, 148.48, 146.74, 133.16, 130.45, 131.73, 129.74, 125.93, 123.33, 122.20, 120.39, 111.83, 40.10, 21.01. HRMS: m/z calcd for C19H19NO3： 309.1365 and found 309.1372。