CD163抗体的应用

背景^[1-3]

CD163抗体是一类可以特异性结合CD163的多克隆抗体，主要用于体外检测CD163的免疫学实验。

CD163是SRCR超家族成员之一，又称为血红蛋白清道夫受体（hemoglobin scavenger receptor,HbSR）、M130或p155。CD163的表达水平受很多因素调节，糖皮质激素及抗炎介质如IL-10以及IL-6能上调CD163,而促炎介质如脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）以及TNF-α则抑制CD163表达。

CD163抗体免疫组化

CD163是一种I型膜蛋白，又称为M130抗原、Ber-Mac3、Ki-M8或SM4主要表达于单核/巨噬细胞系统，但在淋巴滤泡生发中心、套区的FDC细胞中表达阴性。作为一种新型的组织细胞标记物，该抗体主要用于单核、巨噬细胞及其肿瘤的诊断与研究。此外，CD163在FDC肉瘤的诊断方面具有重要意义。如果CD163呈阳性表达，可排除FDC肉瘤。

据报道，CD163蛋白表达在所有循环血单细胞和大多数组织（除淋巴滤泡套区与生发中心）的巨噬细胞、指突状网状细胞与朗格汉斯细胞中，此外，炎性病变的多枋细胞不表达CD163蛋白。CD163蛋白通过糖皮质激素上调，通过免疫抑制剂环孢素A佛波醇酯（phorbolester）下调，而脂多糖为炎症介质，对表达没有影响。人单核细胞可溶性CD163抗原特异性释放机制可能在调节炎症过程中起重要作用。

应用^[4][5]

用于CD163分子在PRRSV-ADE中的作用研究

首先HS将PRRSV粒子吸附到细胞表面,引起Sn N端唾液酸结合位点与病毒的GP5/M复合体结合,激活Sn信号通道诱发细胞的内吞作用,之后在CD163分子的作用下将PRRSV基因组mRNA释放到细胞浆中,继而完成细胞的复制过程。还有研究表明CD163分子的SRCR5的结构域可以与病毒粒子的GP2和GP4蛋白发生相互作用。然而目前对于CD163分子在PRRSV入侵宿主细胞的过程中的作用机制还不是十分清楚,而且对其在PRRSV-ADE过程中的是否发挥作用的研究还未见报道。因此本试验分4个片段克隆并原核表达CD163分子胞外区结构域,免疫小鼠得阳性血清,制备并纯化其相应的特异性多克隆抗体,通过研究这些抗体是否能够阻断PRRSV和免疫复合物的感染来鉴定CD163分子在PRRSV入侵过程中的作用,以及探索其在PRRSV-ADE中的作用。

清道夫受体CD163蛋白大小是130KDa,故被称为M130蛋白,是Ⅰ型糖基化蛋白,富含半胱氨酸。经软件预测分析猪PAM的CD163发现其包括胞外区、跨膜区和胞质尾区,且胞外区含有一个信号肽（1-40AA）和9个富含半胱氨酸（SRCR）结构域,且1-9个SRCR结构域在CD163中的位置分别是54AA-151AA,161AA-258AA,268AA-365AA,375AA-472AA,480AA-577AA,585AA-682AA,721AA-818AA,828AA-925AA,931AA-1028AA。本试验将CD163分子分四个片段进行克隆和原核表达,即CD163-P1（SRCR1-2）,CD163-P2（SRCR3-4）,CD163-P3（SRCR5-6）和CD163-P4（SRCR7-9）。用四种重组蛋白分别免疫小鼠制备多克隆抗体血清,经硫酸铵盐析法和DE-52离子交换层析技术二步法提取并纯化得到四种纯度较高的特异性抗体。

用PBS灌洗法将猪肺泡原代巨噬细胞洗出并铺板,之后加入四种纯化后的抗CD163抗体和混合抗体孵育1h封闭PAM细胞,再分别用Hn-1/06PRRSV4倍稀释的PRRSV-IgG免疫复合物处理细胞24h和48h,并设置阴性对照和空白对照组。用已建立的PRRSV SYBR Green I实时定量PCR方法检测感染细胞中PRRSV的mRNA水平再用GraphPad Prism5软件进行处理所得到的数据。

首先从健康仔猪肺泡中收集猪肺泡巨噬细胞（PAM）,提取细胞总RNA,参照GenBank:EU016226.1四个不同片段设计四对特异性引物,再用RT-PCR方法扩增出四个CD163基因片段,长度分别为698bp、721bp、609bp和988bp,并将这些基因片段亚克隆到质粒载体PET-32a中,构建重组表达质粒PET-CD163-P1,PET-CD163-P2,PET-CD163-P3和PET-CD163-P4。将重组质粒转化到表达菌BL21中,经IPTG诱导得到成功表达,表达蛋白大小分别约为44.2kDa、45kDa、41.4kDa和52.0kDa,与预测的融合蛋白大小一致。通过优化IPTG诱导表达的时间和最适浓度,大量表达重组蛋白CD163-P1,CD163-P2,CD163-P3和CD163-P4,并用尿素法洗涤纯化重组蛋白。用四种纯化重组蛋白1分别免疫小鼠,制备抗四种重组蛋白的多克隆抗体,经间接ELISA方法检测阳性抗体血清效价分别为1：10240,1：12800,1：25600和1：12800。采用硫酸铵盐析法粗提抗体IgG,再经DE-52纤维素离子交换层析技术方法纯化粗提IgG,用紫外分光光度计测定蛋白浓度。

参考文献

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[2]Influence of N-linked glycosylation of minor proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on infectious virus recovery and receptor interaction[J].Zuzhang Wei,Debin Tian,Lichang Sun,Tao Lin,Fei Gao,Runxia Liu,Guangzhi Tong,Shishan Yuan.Virology.2012(1)

[3]Ligation of Fc gamma receptor IIB enhances levels of antiviral cytokine in response to PRRSV infection in vitro[J].Yina Zhang,Yonghui Zhou,Qingyuan Yang,Chunlong Mu,Erzhen Duan,Jing Chen,Mingfan Yang,Pingan Xia,Baoan Cui.Veterinary Microbiology.2012(3-4)

[4]Sialoadhesin in recognition of self and non-self[J].Mariliis Klaas,Paul Crocker.Seminars in Immunopathology.2012(3)

[5]秦运杰.CD163分子在PRRSV-ADE中的作用[D].河南农业大学,2014.