异戊烯半胱氨酸羧基甲基转移酶抗体的应用

背景^[1-3]

异戊烯半胱氨酸羧基甲基转移酶抗体是一类可以特异性结合异戊烯半胱氨酸羧基甲基转移酶的多克隆抗体，主要用于体外检测异戊烯半胱氨酸羧基甲基转移酶的WB、Elisa、IP、IF、IHC等免疫学实验。

人体中已经发现超过120种蛋白质被异戊二烯化修饰，包括多种异源三聚体G蛋白的γ亚基、小GTP酶的Ras超家族成员、核纤层蛋白以及几种蛋白激酶和蛋白磷酸酶。

异戊烯半胱氨酸羧基甲基转移酶

目前发现的萜类基团有两种：15个碳（倍半萜）的法尼基（farnesyl），20个碳（二萜）的基香叶基香叶基（geranylgeranyl，也称为牻牛儿基牻牛儿基）。香叶是中药名，指香叶天竺葵（牻牛儿苗科植物）的叶子。香叶基是单萜，也叫牻牛儿基。

这两种萜类基团都来自胆固醇合成途径，以法尼基焦磷酸（FPP）或香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）的形式参与反应。催化的酶是法尼基转移酶（FTase）和香叶基香叶基转移酶（GGTase）。GGTase有两种，GGTase-I和GGTase-II，具有不同的底物专一性。

GGTase-I和FTase的底物C末端都具有CAAX共有序列，其中C为半胱氨酸，A为任何脂肪族氨基酸（除丙氨酸外），X为C末端氨基酸。异戊二烯化之后，AAX通常会被切除，C就成为羧基末端，并被羧甲基化。

CaaX序列中的X残基决定了蛋白是法尼基化还是香叶基香叶基化。FTase优先选择X残基为丙氨酸、丝氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺的CaaX序列，而亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸是GGTase-I的首选。

这种底物特异性并非互斥，K-Ras和Rho B蛋白就表现出重叠的特异性。K-Ras蛋白的CVIM序列通常在哺乳动物细胞中被法尼基化，但当FTase被抑制时，它也可以被GGTase-I催化。Rho B的C端序列是CKVL，在细胞中是两种修饰共存的。

负责切除AAX残基的酶包括Ras转化酶（Rce1）和锌金属蛋白酶Ste24（ZMPSte24），在各种组织中均有表达。催化C-末端半胱氨酸羧甲基化的是异戊烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶（isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase，ICMT)。

GGTase-II则催化两个香叶基香叶基添加到底物蛋白C端附近的CXC或CCXX）的两个半胱氨酸残基上，之后无需酶切。

因为萜类基团来自于胆固醇合成途径，所以异戊二烯化发生在细胞质中。不过反应也不是完全在胞浆中进行，而是与内质网、高尔基体和质膜相关。异戊二烯化可以增加蛋白质对膜的亲和力，从而调节其定位和运输。

应用^[4][5]

用于张力负荷下CC复合体介导的RhoA信号通路对大鼠终板软骨细胞退变的影响与作用研究

在体外建立大鼠终板软骨细胞张力诱导退变模型,研究P-120catenin蛋白与RhoA/ROCK-1信号通路在体外张力诱导下终板软骨细胞退变相互作用。

方法:无菌条件下操作处理并分离大鼠腰椎部位终板软骨,利用胶原酶以及胰酶提取终板软骨细胞,培养并采用第二代终板软骨细胞,采用FX-5000仪器施加牵张力建立终板软骨细胞体外张力载荷模型;利用LIVE/DEAD染色方法以及流式细胞学检测细胞的存活率和细胞凋亡;通过鬼笔环肽染色来对终板软骨细胞的细胞骨架变化进行检测;采用组织学染色方法检测脊柱组织以及终板软骨细胞的细胞外基质退变表达;同时通过RhoA/ROCK-1信号通路抑制剂以及过表达E-cadherin、P120-catenin质粒转染对实验进行调控检测来抑制各个信号及蛋白基因的表达,来观察其对终板软骨细胞的影响;利用免疫共沉淀技术分析检测E-cadherin和P120-catenin、P120-catenin和RhoA之间的相互偶联作用;通过Realtime RT-PCR和Western blot检测张力加载前后以及施加调控后的软骨标志基因二型胶原、SOX-9、蛋白聚糖的基因和蛋白表达进行检测;免疫荧光检测各个蛋白在终板软骨细胞中的定位和表达;

结果:通过张力加载后,终板软骨细胞中相关基因二型胶原、Sox9基因及蛋白聚糖的表达随着加力的延长逐渐下调,软骨细胞细胞外基质的合成受到明显抑制。同时牵张力刺激能够改变终板软骨细胞的细胞骨架发生明显改变,而终板软骨细胞的凋亡则未见差异。

随着张力加载的作用下,终板软骨细胞中RhoA/ROCK-1的基因与蛋白的表达明显增高;抑制RhoA/ROCK-1信号通路后相关基因及蛋白表达降低,而终板软骨细胞的退变明显减轻。

张力载荷作用下终板软骨细胞中P120-catenin基因及蛋白水平均明显降低,同时P120-catenin与E-cadherin蛋白之间的相互结合作用明显降低;过表达P120-catenin蛋白后,软骨细胞中P120-catenin基因表达显著增高,E-cadherin的表达也明显升高,P120-catenin和E-cadherin之间的相互结合作用也明显升高,RhoA/ROCK-1信号通路相关蛋白表达则有显著降低,而张力作用下的终板软骨细胞退变状况也明显减轻。

参考文献

[1]＜sup＞19＜/sup＞F NMR and DFT Analysis Reveal Structural and Electronic Transition State Features for RhoA‐Catalyzed GTP Hydrolysis[J].Yi Jin,Robert W.Molt,Jonathan P.Waltho,Nigel G.J.Richards,G.Michael Blackburn.Angew.Chem..2016(10)

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[3]p120‐Catenin modulating nuclear factor‐κB activation is partially R ho A/ROCK dependent in scratch injury[J].Shenghui Qin,Lingzhi Qin,Chao Zhang,Liwei Liu,Wenjia Sun,Naping Li,Renliang Wu,Xi Wang.Wound Rep and Reg.2015(2)

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[5]马明明.张力负荷下CC复合体介导的RhoA信号通路对大鼠终板软骨细胞退变的影响与作用[D].皖南医学院,2016.