人内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(VASPIN)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(VASPIN)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(VASPIN)的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(VASPIN)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(VASPIN)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(VASPIN)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤：

1.编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）

2.加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50µl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品10µl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

15分钟.

10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于血清vaspin、网膜素水平与肥胖、2型糖尿病的相关性研究

检测不同血糖水平及体重人群中空腹内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂（vaspin）与网膜素（omentin）水平的改变。进一步研究这两种脂肪因子和糖脂代谢因素及相关生化指标之间的可能联系。从而探求vaspin与omentin分别在肥胖、2型糖尿病的进展中发挥的可能作用。

方法：采用ELISA测定22例2型糖尿病（T2DM）超重/肥胖者、25例T2DM正常体重者、20例正常糖调节（NGR）超重/肥胖者及21例NGR正常体重者晨起空腹状态下血清vaspin和网膜素浓度；并检测实验对象的空腹血糖（FBG）、空腹血浆胰岛素（FINS）、糖化血红蛋白（HbA1c）、餐后2小时血糖（PG2h）、总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、身高、体质量、腰围（W）、臀围（H）、并计算腰臀比（WHR）、体重指数（BMI）;通过稳态模型评估法计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）：HOMA-IR=FBG×FINS/22.5.

结果：1.T2DM组血清vaspin浓度（1.39±0.39ng/ml）高于NGR组1.16±0.5ng/ml)（P=0.017）；肥胖组（OW/OB）血清vaspin浓度（1.55±0.41ng/ml）高于正常体重组（NW）（1.04±0.36ng/ml）（P＜0.01）；在男性组与女性组间血清vaspin水平存在显著差异，男性组（1.2±0.49ng/ml）低于女性组（1.42±0.36ng/ml）（P=0.04）；通过Pearson相关分析后发现，血清vaspin水平与BW、BMI、WHR、HOMA-IR、FPG、PG2h、HbA1c呈显著正相关（r=0.501、r=0.753、r=0.841、r=0.258、r=0.22、r=0.253、r=0.227）而与Age、FINS、TG、TC、HDL-C、LDL-C无相关性。采用多元线性逐步回归分析发现性别、WHR、HOMA-IR可作为血清vaspin独立相关因素（P＜0.05）。

2.T2DM组血清omentin浓度（17.965±3.215ug/l）低于NGR组（20.037±4.257ug/l）（P=0.011）；肥胖组（OW/OB）血清omentin浓度（15.626±2.298ug/l）低于正常体重组（NW）（21.948±2.108ug/ml）（P＜0.05）；在不同性别组间血清omentin水平存在显著差异性，女性（20.309±3.641ug/l）高于男性（18.104±3.776ug/l）（P=0.009）；采用Pearson相关分析发现，实验对象血清omentin水平与BW、BMI、WHR、HOMA-IR、FPG、PG2h、HbA1c呈显著负相关（r=－0.834、r=－0.95、r=－0.859、r=－0.255、r=－0.246、r=－0.275、r=－0.28）而与Age、FINS、TG、TC、HDL-C、LDL-C无关。采用多元线性逐步回归分析发现BMI、WHR是血清omentin水平的独立相关因素（P＜0.05）。

参考文献

[1]Elevated circulating vaspin levels were decreased by rosiglitazone therapy in T2DM patients with poor glycemic control on metformin alone[J].Lili Zhang,Ling Li,Mengliu Yang,Hua Liu,Gangyi Yang.Cytokine.2011(2)

[2]Vaspin and visfatin/Nampt are interesting interrelated adipokines playing a role in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus[J].Hala O.El-Mesallamy,Dina H.Kassem,Ebtehal El-Demerdash,Ashraf I.Amin.Metabolism.2011(1)

[3]Circadian Rhythm of Serum Vaspin in Healthy Male Volunteers:Relation to Meals[J].Eunheui Jeong,Byung-Soo Youn,Dong Woo Kim,Eun Hee Kim,Ji Woo Park,Churl Namkoong,Ji Yun Jeong,So Yoon Yoon,Joong Yeol Park,Ki-Up Lee,Min-Seon Kim.The Journal of Clinical Endocrinology＆Metabolism.2010(4)

[4]Pioglitazone Treatment Enlarges Subcutaneous Adipocytes in Insulin-Resistant Patients[J].Tim B.Koenen,Cees J.Tack,Jeanne Margot Kroese,Ad R.Hermus,Fred C.G.Sweep,Jeroen van der Laak,Anton F.H.Stalenhoef,Jacqueline de Graaf,Lambertus J.H.van Tits,Rinke Stienstra.The Journal of Clinical Endocrinology＆Metabolism.2009(11)

[5]黄仕鹏.血清vaspin、网膜素水平与肥胖、2型糖尿病的相关性研究[D].南昌大学,2013.