人基质金属蛋白酶7(MMP-7)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人基质金属蛋白酶7(MMP-7)ELISA试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析人血清、血浆、细胞裂解液、唾液、尿液或细胞培养上清中MMP-7的含量。

检测原理：预先包被的抗体和检测相抗体都是亲和纯化级的MMP-7多克隆抗体。检测抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MMP-7呈正相关。

人基质金属蛋白酶7(MMP-7)ELISA试剂盒

基质金属蛋白酶是依赖锌和钙的内肽酶，能够降解细胞外基质的所有成分。它们在许多生理过程中发挥重要作用，如胚胎发育、组织成型、复制、再生等。它们参与很多病理过程如关节炎、癌症、心血管疾病。新合成MMPs的量主要由复制水平控制。MMPs的活性主要由酶原的活化和其抑制蛋白质（TIMPs）所调节。MMP-7由正常和疾病组织的上皮细胞分泌。MMP-7可降解一系列基质如Ⅳ型胶原，明胶，弹性蛋白和层联蛋白。MMP-7还能激活UPA和前MMP-1,2,9。本试剂盒所用标准品为重组人MMP-7，包含250个氨基酸，分子量28KDa。所检测MMP-7包括酶原和活性酶。

操作步骤

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照随货说明书中图表在小试管中进行稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于MMP1\7调控人舌鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭研究

体外合成相应的siRNA干扰序列和经过测序鉴定序列正确的过表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1–Puro-MMP1\7（以下简称pCDH-MMP1\7）,转染人舌癌细胞CAL27\SCC9后利用RT-PCR技术和蛋白免疫印迹实验分别在mRNA和蛋白水平验证MMP1\7的干扰和过表达效果;通过CCK8增殖实验和平板克隆形成实验探讨当抑制和过表达MMP1\7基因后舌癌细胞增殖能力的变化;采用划痕愈合实验以及侵袭小室实验研究抑制和过表达MMP1\7基因对舌癌细胞迁移、侵袭能力的影响。

研究发现,Notch信号通路和WNT信号通路与舌癌细胞株的增殖、迁移和侵袭密切相关,且相关文献报道MMPs可作为这两个信号通路的下游靶基因共同调控恶性肿瘤的迁移侵袭,因此分别抑制Notch信号通路和WNT信号通路后,利用蛋白免疫印迹技术在蛋白水平上检测MMP1表达的变化,探究MMP1是否作为Notch信号通路和WNT信号通路的靶基因影响舌癌的迁移侵袭;鉴于TIMP1为MMPs的天然抑制剂分子,两者表达失衡被认为是很多肿瘤迁移侵袭的原因之一,选取15对舌癌标本检验TIMP1mRNA在舌癌组织与癌旁组织表达情况,探讨MMP1\7及TIMP1在舌癌中可能的关系;

另外根据之前相关文献报道,干扰MMP7基因后基质金属蛋白酶其他家族成员MMPs、其天然抑制剂TIMPs以及CDH1的表达将发生改变,因此在CAL27\SCC9人舌癌细胞中干扰MMP7后利用RT-PCR法检测这些分子在mRNA水平的变化情况。经过前面体外细胞学实验得到MMP7基因可影响舌癌细胞的迁移和侵袭能力,为了探索其在体内是否也发挥了相似的作用,利用前期课题组经体内筛选得到的舌鳞状细胞癌裸鼠正位淋巴道高转移细胞株（LN4）,shRNA沉默MMP7基因后观察舌癌细胞转移能力的变化。

结果：siRNA和pCDH-MMP1\7质粒转染CAL27\SCC9细胞后,RT-PCR和蛋白免疫印迹实验结果显示,与对照组相比,实验组MMP1\7表达明显下调和上调;CCK8增殖曲线和平板克隆实验证明经MMP1\7siRNA处理后的细胞增殖能力明显降低,质粒过表达后增殖能力增强;划痕愈合实验、侵袭小室实验证实,抑制MMP1\7后CAL27\SCC9细胞的迁移侵袭能力随之降低,质粒过表达后迁移能力则增强。

抑制Notch信号通路和WNT信号通路后MMP1蛋白表达明显下调;RT-PCR实验结果表明CAL27细胞干扰MMP7后在mRNA水平MMP1\3\10\13、TIMP1以及CDH1表达上调,而MMP9、TIMP2\3\4则相应的下调,在SCC9细胞干扰MMP7后MMP3\10\13、TIMP1以及CDH1表达上调,而MMP9的表达则下调;15对标本中发现其中的13对（86.7%）癌旁组织中的TIMP1表达较癌组织高,而这13例癌组织全部同时高表达MMP1且其中有11例（73.3%）的癌组织同时高表达MMP7和低表达TIMP1,相关性分析发现MMP1与TIMP1在舌癌中呈现负相关性。裸鼠舌癌正位高转移模型移植瘤中抑制MMP7表达,转移率随之降低。

参考文献

[1]BMP-6 inhibits the metastasis of MDA-MB-231 breast cancer cells by regulatingMMP-1 expression[J].Fen Hu,Yunfeng Zhang,Mi Li,Lina Zhao,Jing Chen,Shuang Yang,Xiujun Zhang.Oncology Reports.2016(3)

[2]MMP-7 is a highly specific negative marker for benign and malignant mesothelial cells in serous effusions[J].Ben Davidson,Helene Tuft Stavnes,Ellen Hellesylt,Thomas Hager,Pio Zeppa,Maurizio Pinamonti,Jeremias Wohlschlaeger.Human Pathology.2015

[3]The role of components of the extracellular matrix and inflammation on oral squamous cell carcinoma metastasis[J].Tuncay Tanis,Zeynep Birsu Cincin,Bilge Gokcen-Rohlig,Elif Sinem Bireller,Murat Ulusan,Cem Rustu Tanyel,Bedia Cakmakoglu.Archives of Oral Biology.2014(11)

[4]The roles of canonical and non-canonical Wnt signaling in human de-differentiated articular chondrocytes[J].N Sassi,L Laadhar,M Allouche,B Zandieh-Doulabi,M Hamdoun,J Klein-Nulend,S Makni,S Sellami.Biotechnic＆Histochemistry.2014(1)

[5]袁硕.MMP1\7调控人舌鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭[D].福建医科大学,2018.