人乙酰胆碱(ACH)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人乙酰胆碱(ACH)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人乙酰胆碱（ACH）的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人乙酰胆碱（ACH）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人乙酰胆碱（ACH）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人乙酰胆碱(ACH)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

[实验结果计算]

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于重组人乙酰胆碱酯酶的表达纯化及其抑制剂筛选研究

利用体外人胚肾（HEK293）细胞建立表达重组人乙酰胆碱酯酶（Recombinant human acetylcholinesterase,rhAChE）的表达系统,使用pCMV-AChE质粒对其进行瞬时转染,分泌表达酶液到培养基,并通过对酶动力学的研究来考察重组表达蛋白的酶活性。使用DEAE-Sepharose FF亲和层析对高效表达的重组蛋白进行纯化,以获得纯度较高、活性较强的重组人乙酰胆碱酯酶,从而建立重组人乙酰胆碱酯酶抑制剂的体外评价筛选模型,并应用该模型从天然产物及其衍生物中筛选其中药抑制剂和对一系列化合物的抑制活性的测定。

1、HEK293细胞分泌表达重组人乙酰胆碱酯酶（rhAChE）pcmv-ache质粒由浙江大学药学院所赠送。测定pcmv-ache的dna序列确证ache部分与ache结构基因序列（genbankaccessionno:nm--000665）一致。通过阳离子脂质体lipofectaminetm2000介导pcmv-ache从而对hek293细胞进行瞬时转染。建立此表达系统分泌表达的rhache至细胞培养液中,收集细胞培养液作为酶液,进行ache活性分析,最终获得粗酶液进行下一步纯化。

2、rhache活性和检测体系研究采用改进的ellman方法进行酶活检测:反应体系中加入酶液和显色剂dtnb（5,5,-二硫代双-2-二硝基苯甲酸）,ph7.4的pbs,在37℃培养箱孵育6min,加入底物碘化硫代乙酰胆碱（atch）后37℃继续孵育16min,最后加入sds终止反应,使用酶标仪测定在412nm下的吸光度（od值）,rhache的反应速率单位用od/min来表示。

3、rhache的纯化和鉴定为获得纯度更高、活性更强的rhache,对收集的细胞培养液即酶液进行活性分析后,通过透析过夜,使用deae-sepharoseff亲和层析柱梯度洗脱纯化,收集蛋白纯化液,进行活性检测,聚乙二醇4000进行5倍浓缩,bca蛋白浓度试剂盒测得蛋白浓度为0.145mg/ml,纯化液比活力为6.55u/mg,纯化倍数为9.63,酶活回收率为56%。该酶的相对分子质量约为64kd。以碘化硫代乙酰胆碱为底物时,酶的最适反应温度为37℃,最适ph为7.4,最适底物浓度为5mmol/l。进行sds-page、native-page鉴定,在分子量64kd附近出现明显的rhache的单一条带。纯化液进行westernblot分析,一抗为anti-acheantibody抗体,在分子量64kd附近出现明显rhache单一条带。由于重组人乙酰胆碱酯酶的纯度会直接决定最终检测的准确性和可靠性,本实验对人的乙酰胆碱酯酶的分离纯化及生物学方面的意义做了研究,即如何使rhache的纯化效率达到,减少及简化纯化步骤,使酶活的损失降低,以提高纯化的倍数。

4、rhache抑制剂的筛选多奈哌齐对ache是可逆性的抑制剂,其在粗酶液的ic50为14.0nmol/l。本研究选择7个浓度来测定多奈哌齐对纯化液rhache的抑制率效果,以化合物摩尔浓度的负对数和酶抑制率进行线性回归,求取ic50值。反应体系条件:ph7.4,酶量5μl,多奈哌齐浓度:0,5.0,10.0,20.0,40.0,80.0,160nmol/l,底物浓度:0.5mmol/l,反应温度37℃,反应时间16min。结果测得纯化后的rhache的ic50明显降低为5.0nmol/l左右。利用以上建立的人乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究模型进行rhAChE抑制活性评价和化合物的筛选,对评价后具有显著抑制活性的有效部位进行含量测定和结构鉴定。同时可以更高效、快捷的对来自天然药物中乙酰胆碱酯酶抑制剂成分作进一步筛选、鉴定。

参考文献

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[2]Synthesis,biological evaluation and molecular modeling of oxoisoaporphine and oxoaporphine derivatives as new dual inhibitors of acetylcholinesterase/butyrylcholinesterase[J].Huang Tang,Yong-Biao Wei,Chi Zhang,Fang-Xian Ning,Wei Qiao,Shi-Liang Huang,Lin Ma,Zhi-Shu Huang,Lian-Quan Gu.European Journal of Medicinal Chemistry.2009(6)

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[5]吴怀秀.重组人乙酰胆碱酯酶的表达纯化及其抑制剂筛选[D].浙江农林大学,2015.