人L-乳酸脱氢酶(L-LDH)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人L-乳酸脱氢酶(L-LDH)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人L-乳酸脱氢酶（L-LDH）的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人L-乳酸脱氢酶（L-LDH）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人L-乳酸脱氢酶（L-LDH）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人L-乳酸脱氢酶(L-LDH)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

[实验结果计算]

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用[4][5]

用于干酪乳杆菌L-乳酸脱氢酶的表达、定向改造及应用研究

光学纯L-PLA是一种高附加值的有机酸和天然防腐剂,在食品、饲料、制药和材料等领域有广阔的应用前景。目前已有多种可催化PPA的L-LDH被发现,但至今仍未有一种L-LDH能够满足工业生产的要求。

酶的催化活性低、稳定性差和选择性不高等缺陷极大地限制了其的工业化应用。为获得一种性状优良的L-LDH,本研究将来源于干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CICIM B1192的三种L-LDH基因分别在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中实现表达。比较这三种L-LDH对PPA的活性后,确定了高活性的L-Lc LDH1。

在此基础上,基于理性设计提高该酶对PPA的催化活性并进行应用工艺的初步研究,主要研究成果如下:以L.casei总DNA为模板,采用PCR技术扩增出三种L-LDH的编码基因Lcldh1、Lcldh2和Lcldh3。借助表达质粒pET-22b（+）将这三种基因分别在E.coli BL21（DE3）中实现了表达。E.coli/Lcldh1全细胞在相同条件下催化10 mM PPA生成了6.9 mM L-PLA,对映体过量值（eep）＞99%,显著高于E.coli/Lcldh2和E.coli/Lcldh3。

另外,L-LcLDH1、L-LcLDH2和L-LcLDH3的粗酶液催化PPA的活性分别为21.9 U·mg-1、18.4 U·mg-1和16.9 U·mg-1。以上数据表明了L-LcLDH1对PPA表现出了高的催化活性。利用Ni-NTA亲和层析法纯化了L-LcLDH1,其比活性为75.5 U·mg-1。酶学性质分析表明,L-LcLDH1最适温度和最适pH值分别为40℃和5.0,在40℃以下及pH值4.5~6.0之间具有较好的稳定性;3 mM Ag+和5 mM Pb2+均对L-LcLDH1的活性具有较强的激活作用;L-Lc LDH1对PPA的Km值为8.23 mM,催化效率(kcat/Km)值为11.5 m M-1·s-1。

基于理性设计确定了四个关键氨基酸突变位点,利用全质粒PCR法分别构建了四个重组质粒pET-22b-Lcldh1Q88R、-Lcldh1D183N、-Lcldh1I229A、-Lcldh1T235G,转化E.coli BL21（DE3）。

以PPA为底物,L-Lc LDH1Q88R和L-LcLDH1I229A的比活性分别为451.5U·mg-1和512.4 U·mg-1。二者的kcat/Km值分别是L-LcLDH1的4.8和5.2倍。随后,分别以pET-22b-Lcldh1Q88R和pET-22b-Lcldh1I229A为模板,构建了两个定点饱和突变文库E.coli/Lcldh1Q88R/I229X和E.coli/Lcldh1I229A/Q88X。经过两步筛选从这两个突变文库中筛选出转化子E.coli/Lcldh1Q88R/I229Q和E.coli/Lcldh1I229A/Q88A。L-LcLDH1Q88R/I229Q和L-LcLDH1I229A/Q88A对PPA表现出了较高的比活性,分别是L-Lc LDH1的19.9和38.8倍。另外,二者的kcat/Km值分别是L-LcLDH1的6.8和35.2倍。突变酶L-LcLDH1I229A/Q88A对PPA表现出了的催化特性。

以E.coli/Lcldh1I229A/Q88A全细胞为催化剂,催化90 mM以内的PPA时,不对称还原反应可以在10 h内完成,且最终产物L-PLA（eep＞99%）的产率均大于95%。通过分批补加底物,E.coli/Lcldh1I229A/Q88A全细胞催化PPA生成了99.8 mM L-PLA,时空产率为1.4 g·L-1·h-1,是直接催化150 mM PPA生成L-PLA的时空产率(0.4 g·L-1·h-1)的3.5倍。这些研究成果为生物催化制备L-PLA的工业化生产奠定了基础。

参考文献

[1]Characterization of a d-Lactate Dehydrogenase from Lactobacillus fermentum JN248 with High Phenylpyruvate Reductive Activity.[J].Chen Lixia,Bai Yajun,Fan Tai-Ping,Zheng Xiaohui,Cai Yujie.Journal of food science.2017(10)

[2]Structural Characterization of a Eukaryotic Cyanase from Tetranychus urticae.[J].Schlachter Caleb R,Klapper Vincent,Wybouw Nicky,Radford Taylor,Van Leeuwen Thomas,Grbic Miodrag,Chruszcz Maksymilian.Journal of agricultural and food chemistry.2017(27)

[3]Antibacterial activity of phenyllactic acid against Listeria monocytogenes and Escherichia coli by dual mechanisms[J].Yawei Ning,Aihong Yan,Kun Yang,Zhixin Wang,Xingfeng Li,Yingmin Jia.Food Chemistry.2017

[4]Efficient production of enantiomerically pure D-phenyllactate from phenylpyruvate by structure-guided design of an engineered D-lactate dehydrogenase.[J].Wang Min,Zhu Lingfeng,Xu Xiaoling,Wang Limin,Yin Ruochun,Yu Bo.Applied microbiology and biotechnology.2016(17)

[5]李雪晴.干酪乳杆菌L-乳酸脱氢酶的表达、定向改造及应用研究[D].江南大学,2018.