人同型半胱氨酸(HCY)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人同型半胱氨酸(HCY)ELISA试剂盒用于体外定量测定人血清或血浆中同型半胱氨酸(HCY)的含量。

实验原理：人同型半胱氨酸(HCY)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人同型半胱氨酸(Hcy)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人同型半胱氨酸(Hcy)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人同型半胱氨酸(HCY)ELISA试剂盒

样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于血清叶酸、同型半胱氨酸及维生素B12水平与高度鳞状上皮内瘤变和宫颈癌的关系研究

一碳循环和癌症之间的研究逐渐受到重视,叶酸循环和甲硫氨酸循环更是其核心所在。叶酸（FA）、同型半胱氨酸（Hcy）、维生素B12（VitB12）均是循环中的关键物质。

通过检测比较不同人群中FA、Hcy、VitB12水平,探究这些指标与HSIL及宫颈鳞癌（SCC）患病风险、SCC分期、SCC术后病理特征之间的相关性以及它们在SCC诊断中的价值,旨在为宫颈癌的诊断、预防和预后提供更为简便且廉价的检测标志物。

方法:2020年6月1日至2021年1月1日就诊的妇女为研究对象,行HPV+TCT联合检测,HPV16/18者、其他HR-HPV感染同时TCT结果为ASCUS及以上者转诊至阴道镜门诊行阴道镜活检。以病理结果结合TCT结果作为分组依据,分为HSIL组、SCC组和TCT结果为ASCUS但病理学结果为正常的对照组。签署知情同意书、完善调查问卷并抽取空腹肘静脉血样。最终入组共554例,HSIL组187例,SCC组132例,对照组235例。其中,在手术治疗的50例早期SCC患者,I期和IIA期分别为30和20人。血清FA采用化学发光法检测,血清Hcy和Vit B12采用酶联免疫法检测。

结果:1.正常组、HSIL组、SCC组血清FA和Hcy差异均有统计学意义（H=54.977,P<0.001,H=28.556,P<0.001）;而三组间Vit B12差异无统计学意义。Hcy水平与病变程度呈现正相关（r=0.226,P<0.001）,FA水平与宫颈病变程度呈现负相关（r=-0.315,P<0.001）。血清FA与Hcy水平呈现负相关,差异具有统计学意义（P<0.001）。

2. SCC手术后分期间血清FA、Hcy、Vit B12相比较差异无统计学意义。

3. 与高分化患者相比,中分化患者血清FA水平差异有统计学意义（H=13.203,P=0.001）,且明显低于高分化组。其余病理特征组别差异均无统计学意义。

4. 与正常组相比,高FA是患HSIL和SCC的保护因素,FA每升高1 ng/ml,患HSIL和SCC的风险分别降低8.7%和13.4%（P<0.001）,高Hcy是患SCC的危险因素,Hcy每升高1μmol/L,患SCC的风险增加4.6%（P=0.008）。但未发现Vit B12与疾病风险相关。

5. 对宫颈癌的诊断价值评估中,血清Hcy的AUC值为0.631（95%CI为0.589-0.671）,差异有统计学意义（P<0.0001）,其特异度为81.24%;FA的AUC值为0.670（95%CI为0.629-0.709）,差异有统计学意义（P<0.0001）,且血清Hcy和FA截断值分别为16.87μmol/L和4.49 ng/mL。

结论:血清FA、Hcy与HSIL及SCC相关,随着病变程度升高,血清FA逐渐降低,而Hcy逐渐升高,且高水平FA为患HSIL和SCC的保护因素,而高Hcy水平为患SCC危险因素。但并无发现血清指标与宫颈癌分期及病理特征显著相关。血清FA与Hcy单独或联合对宫颈癌患者均有一定的诊断价值。

参考文献

[1]Gender-and age-related differences in homocysteine concentration:a cross-sectional study of the general population of China[J].Xu Ranran,Huang Fei,Wang Yiru,Liu Qingquan,Lv Yongman,Zhang Qian.Scientific Reports.2020(1)

[2]Cysteine and homocysteine as biomarker of various diseases[J].Tahniat Rehman,Muhammad Asim Shabbir,Muhammad Inam‐Ur‐Raheem,Muhammad Faisal Manzoor,Nazir Ahmad,Zhi‐Wei Liu,Muhammad Haseeb Ahmad,Azhari Siddeeg,Muhammad Abid,Rana Muhammad Aadil.Food Science＆Nutrition.2020(9)

[3]Folic Acid Supplementation in Patients with Elevated Homocysteine Levels.[J].Kaye Alan D,Jeha George M,Pham Alex D,Fuller Mitchell C,Lerner Zachary I,Sibley Gerald T,Cornett Elyse M,Urits Ivan,Viswanath Omar,Kevil Christopher G.Advances in therapy.2020(10)

[4]Association of serum folate and vitamin B12 with pre-neoplastic cervical lesions[J].Silva Nayara Nascimento Toledo,Silva Santos Ana Carolina,Carneiro Cláudia Martins,Lima Angélica Alves.Clinical Nutrition ESPEN.2020(prep)

[5]傅培强.血清叶酸、同型半胱氨酸及维生素B12水平与高度鳞状上皮内瘤变和宫颈癌的关系[D].山西医科大学,2021.