小鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)ELISA试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中小鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)水平。用纯化的小鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入小鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)，再与HRP标记的小鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)浓度。

小鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)ELISA试剂盒

样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于硫化氢对大鼠急性肺损伤白介素-4及巨噬细胞炎性蛋白-2表达的影响研究

探讨硫化氢（H2S）对脂多糖（LPS）诱导的大鼠急性肺损伤（acute lung injury,ALI）中白介素-4（interleukin-4,IL-4）和巨噬细胞炎性蛋白-2（macrophage inflammatory protein-2,MIP-2）表达的影响,以及H2S对ALI是否具有保护作用及其可能的机制。

方法：健康雄性SD大鼠27只,随机分为正常对照组,ALI组和NaHS干预组,每组9只。（1）正常对照组：腹腔注射生理盐水0.5ml,10分钟后尾静脉注射生理盐水（2ml/kg）;（2）ALI组：腹腔注射生理盐水0.5ml,10分钟后尾静脉注射LPS（5mg/kg）制造大鼠ALI模型；（3）NaHS干预组：腹腔注射NaHS（28μmol/kg）,10分钟后尾静脉注射LPS（5mg/kg）。观察各组大鼠活动、精神情况、发绀等一般状态的变化,在各组尾静脉注射6小时后将大鼠处死,留取大鼠肺泡灌洗液和肺组织标本。肉眼观察各组肺组织大致改变,取右上肺用福尔马林固定、石腊包埋切片行HE染色,光镜下观察肺组织的病理变化；解剖颈部暴露气管行插管灌洗,每次4℃生理盐2mL重复灌洗3次,用单层纱布过滤,离心后行细胞总数计数,酶联免疫吸附测定（ELISA）肺泡灌洗中IL-4及MIP-2的浓度。

结果：1.肺泡灌洗液中细胞总数的变化：正常对照组大鼠BALF中细胞总数为2.16±0.36（×109/L）;ALI组大鼠BALF的细胞总数为13.524±2.73（×109m）两组比较,ALI组大鼠BALF中细胞总数显著升高（P<0.05）；NaHS干预组BALF中细胞总数为9.92±1.93（×109/L）,低于ALI组,但仍高于正常对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。

2. 肺泡灌洗液中IL-4的变化：正常对照组大鼠BALF中IL-4浓度为5.28±0.32pg/ml;ALI组BAL中IL-4的浓度是5.99±0.63pg/ml,与正常对照组比较显著增加（P<0.05）；NaHS干预组BALF中IL-4为6.62±0.59pg/ml,较正常对照组与ALI组均升高,且差异具有统计学意义（P<0.05）。

3. 肺泡灌洗液中MIP-2的变化：正常对照组大鼠BALF中MIP-2的浓度是1.66±0.18pg/ml,ALI组BALF中MIP-2的浓度为2.99±0.79pg/ml,与正常对照组比较显著增加（P<0.01）；NaHS干预组BALF中MIP-2的浓度为2.14±0.19pg/ml,较ALI组低,但仍高于正常对照,且差异均具有统计学意义（P<0.05）。

结论：1.在脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤肺泡灌洗液中IL-4及MIP-2表达增高；2.硫化氢干预后,IL-4在急性肺损伤中的表达增加,MIP-2在急性肺损伤中的表达减少；3.硫化氢对脂多糖诱导的急性肺损伤可能通过促进IL-4表达与抑制MIP-2的表达起保护作用。

参考文献

[1]Hydrogen sulfide:Regulatory role on blood pressure in hyperhomocysteinemia[J].Sagiraju Sowmya,Yada Swathi,Ai Ling Yeo,Mei Leng Shoon,Philip Keith Moore,Madhav Bhatia.Vascular Pharmacology.2010(3)

[2]ANTI-APOPTOTIC AND ANTI-INFLAMMATORY EFFECTS OF HYDROGEN SULFIDE IN A RAT MODEL OF REGIONAL MYOCARDIAL I/R[J].Ahila Sivarajah,Massimo Collino,Mohammed Yasin,Elisa Benetti,Margherita Gallicchio,Emanuela Mazzon,Salvatore Cuzzocrea,Roberto Fantozzi,Christoph Thiemermann.Shock.2009(3)

[3]Hydrogen sulphide is pro-inflammatory in haemorrhagic shock[J].Y.-Y.P.Mok,P.K.Moore.Inflammation Research.2008(11)

[4]Regulatory Effects of Hydrogen Sulfide on IL-6,IL-8 and IL-10 Levels in the Plasma and Pulmonary Tissue of Rats with Acute Lung Injury[J].Tianshui Li,Bin Zhao,Cong Wang,Haiying Wang,Zhiwei Liu,Wang Li,Hongfang Jin,Chaoshu Tang,Junbao Du.Experimental Biology and Medicine.2008(9)

[5]李铿.硫化氢对大鼠急性肺损伤白介素-4及巨噬细胞炎性蛋白-2表达的影响[D].中南大学,2013.