大鼠金属硫蛋白(MT)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠金属硫蛋白(MT)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中金属硫蛋白(MT)的含量。

实验原理:金属硫蛋白(MT)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被金属硫蛋白(MT)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的金属硫蛋白(MT)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠金属硫蛋白(MT)ELISA试剂盒

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于某54°食用白酒对大鼠肝细胞形态、凋亡指数、凋亡因子及金属硫蛋白表达的影响研究

模拟正常人饮酒的习惯,对SD大鼠进行灌胃,探讨在设定的剂量及时长内,摄入某品牌54°食用白酒,对大鼠肝细胞光镜下细胞形态、超微结构、凋亡指数、凋亡因子（Bcl-2、Bax、TNF-α、Caspase-9、Caspase-12）及金属硫蛋白（metallothionein,MT）表达的影响,为人群健康饮酒提供基础实验依据。

方法:（1）饮酒动物模型建立:115只正常雄性SD大鼠随机分为正常对照组（CG,n=25）及实验组（EG,n=90）;实验组分为低剂量组0.8ml·kg-1·d-1（LG）、中剂量组1.6ml·kg-1·d-1（MG）、高剂量组2.4 ml·kg-1·d-1（HG）。实验组大鼠每日11AM及5PM各灌胃一次,正常组不予处理,分别于第4周、8周、12周、16周、20周末,取肝脏组织;

（2）HE染色技术观察实验各组及正常对照组肝脏组织结构及光镜下细胞形态;

（3）透射电镜技术观察4周、8周、12周实验各组及正常对照组肝细胞超微结构;

（4）TUNEL法检测各组大鼠肝细胞凋亡指数;

（5）免疫组化SABC法、图像分析、形态计量法及免疫蛋白印迹检测各组大鼠肝细胞Bcl-2、Bax表达;

（6）免疫组化SABC法、图像分析、形态计量法检测各组大鼠肝细胞Caspase-9、Caspase-12表达;

（7）免疫组化SABC法、图像分析、形态计量法检测各组大鼠肝细胞TNF-α表达;

（8）免疫组化SABC法、图像分析、形态计量法及免疫蛋白印迹检测各组大鼠肝细胞MT表达;

（9）SPSS 23.0对实验数据进行统计及分析,统计方法为单因素方差分析（One-Way ANOVA）。

结果:（1）HE染色技术显示实验各组和正常对照组肝脏组织结构及光镜下细胞形态未见明显病理改变;

（2）透射电镜技术显示4周、8周、12周实验各组的各剂量组及正常对照组肝细胞超微结构未见明显病理改变。

（3）TUNEL法检测肝细胞凋亡结果显示凋亡阳性细胞核呈棕黄色,实验各组大鼠肝组织细胞凋亡指数较正常对照组未见明显差异,（P＞0.05）;

（4）Bcl-2、Bax免疫组化阳性产物存在于正常对照组及实验各组肝细胞胞质内,实验各组的各剂量组Bcl-2、Bax平均光密度值较正常对照组未见明显差异（P＞0.05）,免疫蛋白印迹显示实验各组的各剂量组Bcl-2、Bax表达水平比较正常对照组未见明显差异（P＞0.05）。

（5）Caspase-9免疫组化阳性产物存在于正常对照组及实验各组肝细胞胞质及胞核内,Caspase-12免疫组化阳性产物存在于正常对照组及实验各组肝细胞胞质内,除Caspase-12的4周MG、12周HG及20周HG稍有增加外（P＜0.05）,实验各组的各剂量组Caspase-9、Caspase-12平均光密度值较正常对照组未见明显差异（P＞0.05）;

（6）TNF-α免疫组化阳性产物存在于正常对照组及实验各组肝细胞胞质内,实验各组的各剂量组TNF-α平均光密度值较正常对照组未见明显差异（P＞0.05）;

（7）MT免疫组化阳性产物存在于正常对照组及实验各组肝细胞胞质内,实验各组的各剂量组MT平均光密度值较正常对照组未见明显差异（P＞0.05）,免疫蛋白印迹显示实验各组的各剂量组MT表达水平比较正常对照组未见明显差异（P＞0.05）。

参考文献

[1]RIPK1 protects hepatocytes from Kupffer cells-mediated TNF-induced apoptosis in mouse models of PAMP-induced hepatitis[J].Aveline Filliol,Claire Piquet-Pellorce,Céline Raguénès-Nicol,Sarah Dion,Muhammad Farooq,Catherine Lucas-Clerc,Peter Vandenabeele,Mathieu J.M.Bertrand,Jacques Le Seyec,Michel Samson.Journal of Hepatology.2017

[2]Cyclophilin D over-expression increases mitochondrial complex III activity and accelerates supercomplex formation[J].Julie C.Etzler,Mariana Bollo,Deborah Holstein,Janice Jianhong Deng,Viviana Perez,Da-ting Lin,Arlan Richardson,Yidong Bai,James D.Lechleiter.Archives of Biochemistry and Biophysics.2017

[3]Alcohol consumption over time and mortality in the Swedish Women’s Lifestyle and Health cohort[J].Idlir Licaj,Sven Sandin,Guri Skeie,Hans-Olov Adami,Nina Roswall,Elisabete Weiderpass.BMJ Open.2016(11)

[4]Alcohol consumption is associated with a lower incidence of acute myocardial infarction:results from a large prospective population‐based study in Norway[J].K.Gémes,I.Janszky,L.E.Laugsand,K.D.László,S.Ahnve,L.J.Vatten,K.J.Mukamal.Journal of Internal Medicine.2016(4)

[5]王燕林.某54°食用白酒对大鼠肝细胞形态、凋亡指数、凋亡因子及金属硫蛋白表达的影响[D].贵州医科大学,2017.