一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒可以高效、快速地从培养的悬浮或贴壁的动物细胞中提取有活性的细胞质及核蛋白，该试剂采用一种温和的可以通过透析去除的非离子型去污试剂，该提取方法高于传统的反复冻溶法和超声法，已经在培养的COS-7、NIH3T3、Hepa 1-6、293、CHO细胞中得到验证，提取的蛋白质可以限度的保持活性，可以用于1D、2D电泳，免疫共沉淀、Pull Down、EMSA、报告基因分析(Luciferase、β-galactosidase、Acetyltransferase等)、蛋白质激酶分析(PKA、PKC、Tyrosine Kinase等)、酶免分析(Western blot、ELISA、RIA)等。

一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒

特点：可以直接裂解贴壁培养的细胞、或经过洗涤和收集的刮下的以及悬浮培养的细胞；

对于贴壁培养的细胞，蛋白提取效率与反复冻溶法相同；对于刮下的以及悬浮培养的细胞，蛋白提取效率高于反复冻溶法和超声破碎法，整个实验过程只需要20 min左右；

提取的蛋白质可以透析去除离子和去污试剂，或将缓冲液替换为所需要的合适缓冲液；

提取的活性蛋白质保持非变性状态，可以直接用于1D和2D电泳、免疫共沉淀、Pull Down、EMSA、蛋白纯化、酶活分析等实验；

可以维持报告基因酶（Luciferase、β-galactosidase、Chloramphenicol Acetyltransferase等）、蛋白质激酶（PKA、PKC、Tyrosine Kinase等）的活性。

应用^[4][5]

用于长期氨暴露仔猪肺组织氧化应激及表面活性蛋白表达规律研究

不同浓度氨暴露下仔猪肺组织氧化应激信号通路检测结果为了进一步探讨氨暴露导致肺泡上皮细胞损伤的分子机制,本研究进一步检测了氧化应激相关指标和信号通路。首先使用ELISA试剂盒对仔猪肺组织总抗氧化物（T-AOC）和DNA损伤标志物8-OHd G进行测定。

结果显示,T-AOC在20ppm和50ppm氨气暴露下均发生极显著下调（P＜0.01）,50ppm氨暴露后8-OHd G发生显著上调（P＜0.05）,表明仔猪肺组织中活性氧显著上升,高浓度氨气暴露下诱导了肺组织的氧化性损伤。接着,我们挑选了抗氧化基因SOD2,GPX-3,HSP70和HSPB7进行基因定量检测。q PCR结果发现,20ppm组氨气暴露后上述抗氧化基因mRNA水平均发生显著下调（P＜0.05）,50ppm组氨气暴露后只有HSPB7基因mRNA水平发生显著下调（P＜0.05）,其他基因表达无显著变化。进一步对氧化应激信号通路的核心因子NRF2和下游抗氧化酶基因NQO1,HO-1以及NRF2的3个上游调控因子P38MAPK,PKC和PI3K进行mRNA和蛋白水平的检验。

结果发现,NRF2,NQO1和HO-1基因mRNA和蛋白水平在20ppm和50ppm氨气暴露后均发生显著（P＜0.05）/极显著上调（P＜0.01）;PKC蛋白在20ppm氨气暴露后发生显著上调（P＜0.05）。以上结果表明氨气诱导活性氧产生,较低浓度下可激活PKC-NRF2-HO-1氧化应激信号通路进行抗氧化反应,但在高浓度下,过多的活性氧不能被有效清除,导致细胞DNA损伤加剧。

不同浓度氨暴露下仔猪肺部炎症反应相关基因表达检测结果由于氧化损伤常常伴随着炎症反应的发生,因此我们选取促炎基因IL-6、NF-κB（P65）和抗炎基因IL-10、IL-13进行基因表达水平检测,验证仔猪肺组织是否发生了炎症反应。q PCR检测结果发现,相比于对照组,促炎因子IL-6在20ppm氨气暴露30天出现显著上调（P＜0.05）,NF-κB（P65）基因在氨暴露后发生显著下调（P＜0.05）,抗炎因子IL-10和IL-13在20ppm和50ppm氨气刺激后发生显著（P＜0.05）或一定程度的下调。进一步对NF-κB（P65）进行蛋白定量。WB结果显示,NF-κB（P65）蛋白在20ppm组显著上调（P＜0.05）,50ppm组显著下调（P＜0.05）。以上结果表明,20ppm氨气暴露下肺组织可能发生了早期炎症反应,主要以促炎反应为主,而在50ppm氨气暴露下可能发生了晚期炎症反应,即组织的损伤和修复。

不同浓度氨暴露下肺表面活性蛋白基因表达规律研究结果上述研究结果表明,氨暴露可诱导AECⅡ的损伤,而AECⅡ一个重要的功能就是合成和分泌表面活性蛋白,以维持肺泡表面张力和参与免疫防御。

因此对肺组织中两种主要的肺表面活性蛋白SP-A1和SP-D的基因表达进行了检测。q PCR和WB结果显示,与对照组相比,20ppm氨气暴露后,SP-A1和SP-D基因mRNA和蛋白表达模式一致,分别发生了极显著（P＜0.01）和显著上调（P＜0.05）;50ppm氨气暴露后,SP-A1基因mRNA表达发生显著上调（P＜0.05）,SP-D基因未发生显著性变化;但SP-A1和SP-D蛋白表达都发生显著性下调（P＜0.01）。

参考文献

[1]Ammonia exposure induces oxidative stress and inflammation by destroying the microtubule structures and the balance of solute carriers in the trachea of pigs[J].Wang Huan,Zeng Xiangyin,Zhang Xinxin,Liu Honggui,Xing Houjuan.Ecotoxicology and Environmental Safety.2021

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[3]The effect of ammonia exposure on energy metabolism and mitochondrial dynamic proteins in chicken thymus:Through oxidative stress,apoptosis,and autophagy[J].Syed Waqas Ali Shah,Dechun Chen,Jingyang Zhang,Yuanlong Liu,Muhammad Ishfaq,You Tang,Xiaohua Teng.Ecotoxicology and Environmental Safety.2020

[4]The inflammatory injury of heart caused by ammonia is realized by oxidative stress and abnormal energy metabolism activating inflammatory pathway[J].Huan Wang,Yu Zhang,Qi Han,Yanmin Xu,Guanghui Hu,Houjuan Xing.Science of the Total Environment.2020(prep)

[5]谌龙.长期氨暴露仔猪肺组织氧化应激及表面活性蛋白表达规律研究[D].华中农业大学,2021.