人抗胰岛素受体抗体(AIRA)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗胰岛素受体抗体(AIRA)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人抗胰岛素受体抗体（AIRA）的含量。

实验原理:试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人抗胰岛素受体抗体（AIRA）捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗胰岛素受体抗体（AIRA）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人抗胰岛素受体抗体(AIRA)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于瘦素对早孕滋养细胞胰岛素受体、胰岛素受体底物-1作用的实验研究

了解瘦素对滋养细胞胰岛素受体信号转导异常的影响。

方法:体外培养人工流产胚胎的绒毛滋养细胞,根据细胞培养基中加入瘦素浓度的不同将实验分为空白对照组以及瘦素浓度分别为100、250、500μg/L的实验组。采用RT-PCR方法测定胰岛素受体底物-1的mRNA表达,并采用Western blot方法测定胰岛素受体、胰岛素受体底物-1的蛋白表达及其酪氨酸磷酸化蛋白的表达。

结果：试验一结果:1.滋养细胞培养及鉴定结果:（1）形态学观察:细胞呈不规则的多角形,核大,卵圆形,细胞浆丰富透明。（2）免疫组化鉴定结果:滋养细胞的波形蛋白染色阴性,角蛋白染色阳性。本实验培养的滋养细胞中细胞角蛋白染色阳性率接近95%,波形蛋白阳性的细胞小于5%,以上的结果均可以证明培养的细胞为滋养细胞。

2. RT-PCR法证实滋养细胞有瘦素mRNA表达:瘦素于340bp处有着强表达。

实验二结果:1.各组细胞膜胰岛素受体及磷酸化胰岛素受体蛋白表达的变化:四组滋养细胞经不同浓度瘦素的培养基培养24小时以后,胰岛素受体蛋白的表达无明显差异,无统计学意义（P>0.05）。磷酸化的胰岛素受体蛋白的表达有着明显差异:瘦素浓度分别为100、250、500μg/L的实验组胰岛素受体的磷酸化水平均显著低于对照组（P<0.05）,并随着瘦素浓度的上升,绒毛滋养细胞膜的胰岛素受体磷酸化水平进一步下降。

3. 各组细胞胰岛素受体底物-1mRNA的表达:四组滋养细胞经不同浓度瘦素的培养基培养24小时后,胰岛素受体底物-1mRNA的表达有着显著差异:浓度分别为100、250、500μg/L的实验组胰岛素受体底物-1mRNA的表达均显著低于对照组（P<0.05）,并发现随着瘦素浓度的上升,胰岛素受体底物-1mRNA表达量相应的下降。

3.各组细胞胰岛素受体底物-1及磷酸化胰岛素受体底物-1蛋白的表达:用不同浓度瘦素的培养基培养四组滋养细胞24小时以后,胰岛素受体底物-1及磷酸化胰岛素受体底物-1蛋白的表达均有着明显差异:各实验组胰岛素受体底物-1及磷酸化胰岛素受体底物-1的蛋白表达量均显著低于对照组（P<0.05）,并发现随着瘦素浓度的上升,滋养细胞的胰岛素受体底物-1蛋白表达及其磷酸化水平均相应下降。

参考文献

[1]Increased expression and cell surface localization of MT1-MMP plays a role in stimulation of MMP-2 activity by leptin in neonatal rat cardiac myofibroblasts[J].Kristin Schram,Maggie M.C.Wong,Rengasamy Palanivel,Eun Kyung No,Ian M.C.Dixon,Gary Sweeney.Journal of Molecular and Cellular Cardiology.2008(5)

[2]Modulation of Adipokines and Cytokines in Gestational Diabetes and Macrosomia[J].J M.Atègbo,O Grissa,A Yessoufou,A Hichami,K L.Dramane,K Moutairou,A Miled,A Grissa,M Jerbi,Z Tabka,N A.Khan.The Journal of Clinical Endocrinology＆Metabolism.2006(10)

[3]Triglyceride Hydrolase Activities and Expression of Fatty Acid Binding Proteins in the Human Placenta in Pregnancies Complicated by Intrauterine Growth Restriction and Diabetes[J].A L.Magnusson,I J.Waterman,M Wennergren,T Jansson,T L.Powell.The Journal of Clinical Endocrinology＆Metabolism.2004(9)

[4]Increased Maternal Plasma Leptin in Early Pregnancy and Risk of Gestational Diabetes Mellitus[J].Chunfang Qiu,Michelle A.Williams,Surab Vadachkoria,Ihunnaya O.Frederick,David A.Luthy.Obstetrics＆Gynecology.2004(3)

[5]李素芬.瘦素对早孕滋养细胞胰岛素受体、胰岛素受体底物-1作用的实验研究[D].第三军医大学,2011.