人抗内因子抗体(IFA)ELISA 试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗内因子抗体(IFA)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中抗内因子抗体(IFA)的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被抗内因子抗体(IFA)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的抗内因子抗体(IFA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人抗内因子抗体(IFA)ELISA试剂盒

样品收集、处理及保存方法

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照随货说明书中图表在小试管中进行稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

计算

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

应用^[4][5]

用于非节段型白癜风血清PCA、IFA、DGP和tTG抗体的检测研究

检测NSV患者血清中PCA、IFA、DGP和tTG抗体的阳性率,探讨其临床意义及抗体血清学筛查的科学价值,为本病的综合评价及治疗提供实验依据。

对象和方法1.对象:选择165例明确诊断的NSV患者,排除单纯糠疹、无色素痣、贫血痣、斑驳病、色素减退性蕈样肉芽肿等色素减退性疾病,其中男97例,女68例。选择年龄性别相匹配的90例作为对照组,其中男性53例,女性37例,分别来自本院体检中心、本院职工、研究生、规培生、实习生或住院患者家属,均无白癜风、色素减退斑、胃肠道疾病及其他自身免疫性疾病史或家族史。

2. 方法:对NSV组和对照组采集空腹肘静脉血4ml,采用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测血清DGP抗体的水平,采用蛋白免疫印迹（western blot,WB）法检测血清PCA、IFA、tTG抗体的表达。统计两组间阳性率,进一步按年龄层次和性别分成不同的亚组,分别统计其阳性率。

3. 统计学方法:应用SPSS17.0统计软件包对所得临床数据进行分析。两组间率的比较采用χ2检验,P<0.05认为有统计学意义。

结果1.PCA在NSV组和对照组的阳性率分别是10.30%和3.33%,两者比较,差异有统计学意义（χ2=3.91,P<0.05）。

2. IFA在NSV组和对照组的阳性率分别是4.85%和1.11%,两者比较,差异无统计学意义（χ2=1.42,P>0.05）。

3. DGP抗体在NSV组和对照组的阳性率分别为10.91%和2.22%,两者比较,差异有统计学意义（χ2=6.08,P<0.05）。

4. tTG抗体在NSV组和对照组的阳性率分别3.63%和1.11%,两者比较,差异无统计学意义（χ2=0.99,P>0.05）。

5. 将NSV组按性别分成男性组和女性组,分别对PCA、IFA、DGP抗体、tTG抗体等的阳性率进行统计,男性组和女性组阳性率依次为9.28%和11.77%;4.12%%和5.88%;11.34%和10.29%;4.12%和2.94%;组间比较显示,差异均无统计学意义（χ2依次为0.27,0.27,0.05和0,均P>0.05）。

6. 将NSV组和对照组按年龄段分成四个亚组（<10岁,11~20岁,21~40岁,41~60岁）,对PCA和DGP抗体在不同年龄段的阳性率分别进行组间比较,未发现不同年龄段之间的阳性率有明显差异。

7.NSV组PCA与IFA双阳性的2例患者均出现维生素B12水平降低与轻度贫血,其中1例胃镜显示多发胃息肉,胃粘膜活检符合AIG的病理改变。

结论1.PCA与DGP抗体阳性率在非节段型白癜风人群明显升高,可作为本型白癜风患者伴发自身免疫性胃炎和乳糜泻的血清学筛查指标。

2.IFA和tTG抗体阳性率在非节段型白癜风人群未见升高,不推荐作为本型白癜风患者伴发自身免疫性胃炎和乳糜泻的血清学筛查指标。

参考文献

[1]Positivity rates of antithyroid antibody,antinuclear antibody and thyroid peroxidase antibody in different types of vitiligo[J].H.K.Lim,M.I.Bae,K.H.Jeong,M.K.Shin,M.‐H.Lee.Clinical and Experimental Dermatology.2016(3)

[2]Type 1 diabetes associated autoimmunity[J].George J.Kahaly,Martin P.Hansen.Autoimmunity Reviews.2016

[3]Celiac autoimmunity in autoimmune thyroid disease is highly prevalent with a questionable impact[J].Bharat Sharma,Ameya Joshi,Premlata Varthakavi,Manoj Chadha,Nikhil Bhagwat,Pratibha Pawal.Indian Journal of Endocrinology and Metabolism.2016(1)

[4]Associated autoimmune diseases in children and adolescents with type 1 diabetes mellitus（T1DM）[J].Kostas Kakleas,Alexandra Soldatou,Feneli Karachaliou,Kyriaki Karavanaki.Autoimmunity Reviews.2015(9)

[5]张凯.非节段型白癜风血清PCA、IFA、DGP和tTG抗体的检测[D].郑州大学,2016.