人抗DNA酶B抗体(ANTI-DNASE B)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗DNA酶B抗体(ANTI-DNASE B)ELISA试剂盒是采用ELISA（酶联免疫）方法，用于测定人血清、血浆及相关液体样本中人抗DNA酶B抗体(anti-DNase B)的含量。

实验原理:试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人抗DNA酶B抗体（anti-DNase B）捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗DNA酶B抗体（anti-DNase B）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人抗DNA酶B抗体(ANTI-DNASE B)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于DNase B基因的克隆及在大肠杆菌中的表达研究

DNase B是A族溶血性链球菌的一种分泌蛋白,序列高度保守,几乎存在于所有A族β-溶血性链球菌中,可用于抗DNA酶B的检测。抗DNA酶B检测是Jones标准所推荐的链球菌感染及其并发症的两种实验诊断方法之一。

然而,A族β-溶血性链球菌的液体培养需要微需氧条件,而且存在高致病性,纯化天然DNase B危险大,工艺复杂,成本高,不利于大量临床检测的开展。为此,本实验克隆了DNase B基因,构建了一个原核表达载体,并且成功的在大肠杆菌中表达了这个蛋白。

实验通过PCR方法扩增出DNase B基因,连接入T载体,测序结果证实序列正确。再次PCR,用KpnI、HindIII双酶切PCR产物,后与同样酶切的pET-41a（+）连接,转化大肠杆菌BL21（DE3）。提取转化子质粒,菌落PCR及酶切鉴定证实DNase B基因片段插入表达载体,测序结果表明本实验所克隆的DNase B基因与GenBank中登录的基因序列同源性在98%以上。

表达菌用1mmol/L的IPTG诱导4小时,收集菌体,破菌,离心,分离上清和包涵体。SDS-PAGE显示,目的蛋白主要以可溶蛋白的形式存在,部分以包涵体形式存在。上清经Ni-NTA凝胶亲和层析,纯度达到91.5%以上。Western-blotting结果显示,重组的GST-DNase B融合蛋白能够特异的与GAS感染患者的阳性血清反应,在55KD处有一条明显的条带。

ELISA实验显示重组蛋白的抗原特异性良好。说明本实验表达的融合蛋白的具有良好的免疫反应性。为抗DNase B抗体的检测及疫苗研制打下坚实的基础。

参考文献

[1] Multiplication in human blood and deoxyribonuclease production by group G streptococci isolated from animals and humans.Reitmeyer JC Guthrie RK,Steele JH,et al.Microbios.1990

[2] Unconventional T cells–New players in antifungal immunity[J].Dunne Margaret R.,Wagener Johannes,Loeffler Juergen,Doherty Derek G.,Rogers Thomas R..Clinical Immunology.2021(prep)

[3] Deep Phenotyping of CD11c+B Cells in Systemic Autoimmunity and Controls＆#13;[J].Rincon Arevalo Hector,Wiedemann Annika,Stefanski Ana Luisa,Lettau Marie,Szelinski Franziska,Fuchs Sebastian,Frei Andreas Philipp,Steinberg Malte,Kam Thong Tony,Hatje Klas,Keller Baerbel,Warnatz Klaus,Radbruch Andreas,Lino Andreia C.,Schrezenmeier Eva,Drner Thomas.Frontiers in Immunology.2021

[4] Function ofγδT cells in tumor immunology and their application to cancer therapy[J].Park Jang Hyun,Lee Heung Kyu.Experimental＆Molecular Medicine.2021(3)

[5]赵宏伟.DNase B基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[D].福建师范大学,2005.