大鼠内毒素(ET)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠内毒素(ET)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中大鼠内毒素(ET)的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠内毒素(ET)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠内毒素(ET)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠内毒素(ET)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于针康法对脑缺血大鼠肠道菌群结构及内毒素、二胺氧化酶、5-羟色胺表达的影响研究

察针康法对局灶性脑缺血大鼠肠道菌群、肠道黏膜屏障、缺血半暗区脑组织5-羟色胺（5-HT）表达及预后的影响。

方法：将90只雄性Sprague-Dawley大鼠随机等分为假手术组、模型组、针刺组、康复组和针康组,每组再等分为3d、7d和14d三个亚组,每个亚组6只。除假手术组外,其余四组采用改良Koizumi线栓法制备永久性脑缺血模型。假手术组和模型组不予治疗,针刺组予头穴丛刺治疗,康复组予跑台康复训练,针康组同时予以上两种治疗。术后14d采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）法检测各组大鼠肠道菌群（双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌）变化。预定时间点用改良神经功能缺损评分（m NSS）检测各组大鼠神经功能缺损情况;酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠肠道黏膜屏障指标血清中内毒素（lipopolysaccharide-binding protein,LPS）、二胺氧化酶（diamine oxidase,DAO）的表达;酶联免疫吸附法（ELISA）检测缺血半暗区脑组织中5-HT的表达。

结果1.改良神经功能缺损评分（m NSS）:术后3d,7d,14d模型组与假手术组相比较,m NSS评分升高（P<0.05）;各治疗组与模型组相比较,m NSS评分降低（P<0.05）;术后7d和14d,针康组与针刺治疗组和康复治疗组相比较,m NSS评分均显著下降（P<0.05）。

2. 目标菌种数量:术后14d,模型组与假手术组相比较,乳酸杆菌和双歧杆菌的数量降低,大肠杆菌和肠球菌的数量上升（P<0.05）;各治疗组与模型组相比较,乳酸杆菌和双歧杆菌的数量均上升,大肠杆菌和肠球菌的数量均降低（P<0.05）;针康组与针刺治疗组和康复治疗组相比较,乳酸杆菌和双歧杆菌的数量显著升高,大肠杆菌和肠球菌的数量均显著降低（P<0.05）。

3. 肠粘膜屏障指标（血清LPS、血清DAO）:血清LPS含量:术后3d,7d,14d模型组与假手术组相比较,血清LPS含量升高（P<0.05）;各治疗组与模型组相比较,血清LPS含量降低（P<0.05）;术后7d和14d,针康组与针刺治疗组和康复治疗组相比较,血清LPS含量均显著降低（P<0.05）。血清DAO含量:术后3d,7d,14d模型组与假手术组相比较,血清DAO含量升高（P<0.05）;各治疗组与模型组相比较,血清DAO含量降低（P<0.05）;术后7d和14d,针康组与针刺治疗组和康复治疗组相比较,血清DAO含量均显著降低（P<0.05）。

4.脑组织5-HT含量:术后3d,7d,14d模型组与假手术组相比较,脑组织5-HT含量降低（P<0.05）;各治疗组与模型组相比较,脑组织5-HT含量升高（P<0.05）;术后3d,7d,14d,针康组与针刺治疗组和康复治疗组相比较,脑组织5-HT含量均显著升高（P<0.05）。

参考文献

[1]Microbiota‐gut‐brain axis:Interaction of gut microbes and their metabolites with host epithelial barriers[J].Y.Bhattarai.Neurogastroenterology＆Motility.2018(6)

[2]Gut reactions:How the blood–brain barrier connects the microbiome and the brain[J].Aric F Logsdon,Michelle A Erickson,Elizabeth M Rhea,Therese S Salameh,William A Banks.Experimental Biology and Medicine.2018(2)

[3]Ischemic stroke damages the intestinal mucosa and induces alteration of the intestinal lymphocytes and CCL19 mRNA in rats[J].Yaning Liu,Shijian Luo,Li Kou,Chaogang Tang,Ruxun Huang,Zhong Pei,Zhendong Li.Neuroscience Letters.2017

[4]Diet-Microbiota Interactions Mediate Global Epigenetic Programming in Multiple Host Tissues[J].Kimberly A.Krautkramer,Julia H.Kreznar,Kymberleigh A.Romano,Eugenio I.Vivas,Gregory A.Barrett-Wilt,Mary E.Rabaglia,Mark P.Keller,Alan D.Attie,Federico E.Rey,John M.Denu.Molecular Cell.2016(5)

[5]冯琳.针康法对脑缺血大鼠肠道菌群结构及内毒素、二胺氧化酶、5-羟色胺表达的影响[D].黑龙江中医药大学,2020.