小鼠Α1微球蛋白(Α1-MG)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠Α1微球蛋白(Α1-MG)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）检测样品中Α1微球蛋白(Α1-MG)的含量。

实验原理：往预先包被α1微球蛋白(α1-MG)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的α1微球蛋白(α1-MG)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

小鼠Α1微球蛋白(Α1-MG)ELISA试剂盒

操作步骤

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于血清胱抑素C联合尿α1微球蛋白检测与糖尿病肾病的相关性分析研究

探讨联合检测T2DM患者血清CysC和尿α1-MG水平与DN的相关性,为DN的早期发现、病情评估、后续治疗和预后提供新的思路。

方法:选取156例2型糖尿病患者作为研究对象。仔细采集研究对象病史、基本资料收集和生化指标检验结果,排除1型糖尿病及其他类型糖尿病患者、应激状态、肾脏实质性病变或尿路感染所致的尿白蛋白阳性者、糖尿病酮症酸中毒或高渗状态、急慢性肝炎或其他急慢性炎症或风湿性疾病等的患者,根据尿白蛋白排泄率（UAER）,分成单纯糖尿病组（SDM）、早期糖尿病肾病组（EDN）、临床糖尿病肾病组（CDN）,分别比较3组研究对象的血清Cys C、尿α1-MG、Scr、BUN水平、阳性率及相关性分析。

结果:1.糖尿病肾病各组一般资料和血、尿化验指标比较结果显示:三组患者间病程、SBP、TC、HbA1C、Cys C、α1-MG、Scr、BUN、mAlb比较,差异均有统计学意义（P<0.05）;患者的年龄、BMI、DBP、TG、HDL-C、LDL-C比较,差异无统计学意义（P>0.05）。

2. 各组对象肾功能指标水平比较结果显示:EDN组和CDN组中,CysC、α1-MG、Scr和BUN水平均有升高,差异有统计学意义（P<0.05）,而且两组中,Cys C、α1-MG指标变化均较Scr和BUN明显,差异有统计学意义（P<0.05）。随着病情的加重,Cys C和α1-MG指标逐渐升高显著,差异有统计学意义（P<0.05）。

3. 各项指标在不同组别中阳性率比较结果显示:随着尿微量白蛋白的增加,各组各项指标阳性率呈递增趋势。在SDM组中,Scr和BUN的阳性检出率较低,不超过5%,在EDN组中,Scr和BUN阳性率也不超过25%,但是CysC和α1-MG在SDM组中的阳性检出率分别达到12.5%和37.5%,尤其以α1-MG为著,特别是将Cys C和α1-MG联合检测,其阳性率可提高到40%,在EDN组中,阳性率达到90.74%,在CDN组中,Cys C联合α1-MG检测阳性率达到100%,与单独Cys C、Scr、BUN阳性率比较,差异有统计学意义（P<0.05）。在EDN组中,各项指标阳性率的阳性检出率从高到低排序为CysC联合α1-MG>α1-MG>Cys C>Scr>BUN。

4. 在糖尿病肾病早期组做相关性分析:血清Cys C与病程、SBP、TC、LDL、HbA1C、Scr、BUN、α1-MG、mAlb有显著的相关关系且都呈正相关,与性别、年龄、BMI、DBP、TG、HDL无相关性。尿α1-MG与病程、HbA1C、Scr、BUN、Cys C、mAlb有显著的相关关系且都呈正相关,与性别、年龄、BMI、SBP、DBP、TC、TG、HDL、LDL无显著相关性。m Alb与SBP、TC、LDL、HbA1C、Scr、BUN、CysC、α1-MG有显著的相关关系且都呈正相关,与性别、年龄、病程、DBP、BMI、TG、HDL无显著相关性。在控制年龄、性别、病程、SBP、DBP、BMI、TC、TG、HDL-L、LDL-L、HbA1C等相关因素后,mAlb与各项临床指标的偏相关结果示:m Alb与CysC、α1-MG相关性较与Scr、BUN相关性好,且均呈正相关,可作为肾小球滤过率间接反映指标,进而评价肾功能损害程度。

结论:血CysC和尿α1-MG对糖尿病肾病早期诊断比Scr、BUN更敏感、更可靠、更有意义。

参考文献

[1]Complications of Diabetes 2016[J].Konstantinos Papatheodorou,Nikolaos Papanas,Maciej Banach,Dimitrios Papazoglou,Michael Edmonds.Journal of Diabetes Research.2016

[2]Diabetic Kidney Disease:Pathophysiology and Therapeutic Targets[J].Stephanie Toth-Manikowski,Mohamed G.Atta,Christian Wadsack.Journal of Diabetes Research.2015

[3]Endogenous fructose production and fructokinase activation mediate renal injury in diabetic nephropathy.[J].Lanaspa Miguel A,Ishimoto Takuji,Cicerchi Christina,Tamura Yoshifuru,Roncal-Jimenez Carlos A,Chen Wei,Tanabe Katsuyuki,Andres-Hernando Ana,Orlicky David J,Finol Esteban,Inaba Shinichiro,Li Nanxing,Rivard Christopher J,Kosugi Tomoki,Sanchez-Lozada Laura G,Petrash J Mark,Sautin Yuri Y,Ejaz A Ahsan,Kitagawa Wataru,Garcia Gabriela E,Bonthron David T,Asipu Aruna,Diggle Christine P,Rodriguez-Iturbe Bernardo,Nakagawa Takahiko,Johnson Richard J.Journal of the American Society of Nephrology:JASN.2014(11)

[4]Diabetic kidney disease:from physiology to therapeutics[J].Carmen Mora‐Fernández,Virginia Domínguez‐Pimentel,Mercedes Muros Fuentes,JoséL.Górriz,Alberto Martínez‐Castelao,Juan F.Navarro‐González.J Physiol.2014(18)

[5]陈小和.血清胱抑素C联合尿α1微球蛋白检测与糖尿病肾病的相关性分析[D].吉林大学,2018.