大鼠胃动素(MTL)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠胃动素(MTL)ELISA试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中的胃动素(MTL)含量。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心法：抗大鼠胃动素(MTL)单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的胃动素(MTL)会与单抗结合，游离的成份被洗去。加入酶标抗体，抗大鼠胃动素(MTL)抗体与结合在单抗上的大鼠胃动素(MTL)结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有胃动素(MTL)，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，胃动素(MTL)浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中的胃动素(MTL)浓度。

大鼠胃动素(MTL)ELISA试剂盒

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2. 血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3. 细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

4. 其它生物样品：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL（在使用前15分钟内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

3.弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4.每孔加酶结合物工作液（临用前15分钟内配制）100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。

5.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

6.每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右（根据实际显示情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。

7.每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

9.实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

应用^[4][5]

用于运脾柔肝方对IBS-C模型大鼠胃动素、生长抑素及SCF/c-kit信号通路的影响研究

对运脾柔肝方药物组成及组方意义、中药药理作用,对运脾柔肝方对IBS-C发挥疗效的理论机制进行研究。

观察运脾柔肝方对IBS-C大鼠血清及结肠组织中胃动素（Motilin MOT）、生长抑素（Somatostatin SS）表达及SCF/c-kit信号通路的影响,探讨运脾柔肝方对IBS-C大鼠肠道动力的改善的作用机制。方法:随机数字表法选取12只wistar大鼠为正常组,其余大鼠采用冰水灌胃法建立IBS-C模型。建模成功后,将大鼠按照随机数字表法分为IBS-C模型组,莫沙必利组和中药低、中、高剂量组,各12只。正常组和IBS-C模型组给予等容积的蒸馏水,莫沙必利组给予1.35mg/（kg·d）混悬液灌胃,中药低、中、高剂量组分别12.2g、24.4g、48.8g/（kg·d）药剂灌胃。计算粪便颗粒数及粪便含水量,墨汁推进实验测定肠道推进率,酶联免疫吸附测定法（ELISA法）和免疫组化法测定大鼠血清和结肠组织中MOT、SS的表达水平,采用免疫组化法和Q-PCR检测结肠组织SCF、c-kit蛋白和mRNA表达水平。

结果:①与正常组比较,IBS-C模型组粪便粒数、粪便含水量、肠道推进率显著降低;与IBS-C模型组比较,给药组粪便颗粒数、粪便含水量、肠道推进率均升高。

②与正常组比较,IBS-C模型组血清和结肠组织中MOT表达降低（P<0.05）,SS表达升高（P<0.05）;与IBS-C模型组比较,给药组血清和结肠组织中MOT表达升高,SS表达降低,其中莫沙必利组和中药中、高剂量组有统计学意义（P<0.05）。

③与正常组比较,IBS-C模型组结肠组织SCF、c-kit蛋白和mRNA表达水平显著降低（P<0.01）;与IBS-C模型组比较,给药组结肠组织中SCF、c-kit蛋白和mRNA表达水平升高,其中除中药低剂量组SCF蛋白表达水平无统计学意义外,其他均有统计学意义（P<0.01～0.05）。

结论:①运脾柔肝方可明显改善IBS-C大鼠排便及粪便性状,提高肠道推进率。

②经药物干预后,给药组血清和结肠组织中MOT表达水平升高,SS表达水平降低,说明运脾柔肝方治疗IBS-C的作用机制之一可能是增强MOT表达并抑制SS表达,调节机体内胃肠激素水平的异常表达,从而改善排便和促进肠道蠕动,改善IBS-C症状。

③经药物干预后,给药组结肠组织中SCF、c-kit蛋白和基因表达增强,运脾柔肝方治疗IBS-C的机制之一可能是通过提高SCF/c-kit信号系统表达来改善肠道动力,从而达到治疗IBS-C的效果。

参考文献

[1]Reduced interstitial cells of Cajal and increased intraepithelial lymphocytes are associated with development of small intestinal bacterial overgrowth in post-infectious IBS mouse model[J].Binrui Chen,Shuwen Zhu,Lijun Du,Huiqin He,John J.Kim,Ning Dai.Scandinavian Journal of Gastroenterology.2017(10)

[2]Role of stem cell growth factor/c-Kit in the pathogenesis of irritablebowel syndrome（Review）[J].Yuna Chai,Yusheng Huang,Hongmei Tang,Xing Tu,Jianbo He,Ting Wang,Qingye Zhang,Fen Xiong,Detang Li,Zhenwen Qiu.Experimental and Therapeutic Medicine.2017(4)

[3]Modulation of enteric neurons by interleukin‐6 and corticotropin‐releasing factor contributes to visceral hypersensitivity and altered colonic motility in a rat model of irritable bowel syndrome[J].Maria M.Buckley,Ken D.O’Halloran,Mark G.Rae,Timothy G.Dinan,Dervla O’Malley.J Physiol.2014(23)

[4]Brain–Gut Microbiome Interactions and Functional Bowel Disorders[J].Emeran A.Mayer,Tor Savidge,Robert J.Shulman.Gastroenterology.2014(6)

[5]刘梦茹.运脾柔肝方对IBS-C模型大鼠胃动素、生长抑素及SCF/c-kit信号通路的影响[D].南京中医药大学,2020.