大鼠脂蛋白磷脂酶A2(LP-PL-A2)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠脂蛋白磷脂酶A2(LP-PL-A2)ELISA试剂盒用于测定大鼠血清，血浆，细胞上清及相关液体样本中大鼠脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PL-A2)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PL-A2)水平。用纯化的大鼠脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PL-A2)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PL-A2)，再与HRP标记的脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PL-A2)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PL-A2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PL-A2)浓度。

大鼠脂蛋白磷脂酶A2(LP-PL-A2)ELISA试剂盒

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

3.样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。

4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于有氧运动降低动脉粥样硬化大鼠血清和组织脂蛋白相关磷脂酶A2的水平及意义研究

前期研究发现运动改善肥胖女青少年糖脂代谢的作用可能与运动降低血清Lp-PLA2水平有关的基础上,研究4周中等强度有氧运动对AS模型大鼠的血清和多个组织（包括肝、腓肠肌和脂肪）Lp-PLA2水平的影响,以探讨Lp-PLA2在运动减轻AS严重程度、糖脂代谢紊乱中的作用及机制,为运动防治AS提供理论依据。

研究方法：选择27只6周龄雄性SD大鼠随机分为正常对照组（Con,n=9）和AS模型组（AS model,n=18）,分别喂以普通饲料和高脂饲料。采用腹腔注射维生素D3联合8周高脂饲料喂养建立AS模型大鼠。随机选择1只Con组、2只AS模型组的大鼠,检测其血脂、血糖水平,麻醉处死大鼠后剥离主动脉进行形态学和病理学检查,以明确是否成功建立AS模型大鼠。将16只AS模型组大鼠随机分为AS组（n=8）和AS运动组（EAS组,n=8）。EAS组进行4周中等强度跑台运动,干预期间3组大鼠全部喂以普通饲料。最后一次跑台运动结束后36 h,采血测糖脂代谢指标（空腹血糖FBG、空腹胰岛素FINS、胆固醇TC、甘油三酯TG、低密度脂蛋白LDL、高密度脂蛋白HDL的水平）;麻醉处死动物后收集肾周脂肪、称重,分离全长主动脉、检测AS程度、并用免疫组化方法检测主动脉的巨噬细胞浸润情况,用ELISA方法检测血清Lp-PLA2水平,以及取肝、腓肠肌和脂肪组织、用Western Blot方法检测Lp-PLA2的蛋白水平。

研究结果1.与C组相比,AS模型组大鼠的血清（P<0.01）、肝、腓肠肌（均P<0.05）和脂肪组织（P<0.01）的Lp-PLA2水平显著升高,同时伴随着糖脂代谢紊乱（表现为TC、TG、LDL水平显著升高,HDL水平显著降低;FBG尽管无显著变化,但FINS显著提高）、主动脉出现AS斑块和AS病理变化、主动脉巨噬细胞浸润增加（巨噬细胞特异性标记分子CD68增加）。

2.4周中等强度有氧运动显著降低AS大鼠血清（P<0.01）、肝（P<0.05）,腓肠肌和脂肪组织（均P<0.01）的Lp-PLA2水平,同时伴随着糖脂代谢紊乱的改善（TC、TG、LDL水平均显著降低,但HDL不改变）、主动脉斑块的减少、主动脉AS病理变化和巨噬细胞浸润程度的减轻。

研究结论1.AS大鼠血清和组织的Lp-PLA2水平显著增加;而4周有氧运动显著降低AS大鼠血清和组织的Lp-PLA2水平。

2.运动降低血清和组织中的Lp-PLA2水平有可能与AS大鼠主动脉AS严重程度和糖脂代谢的改善有关。同时,减少的Lp-PLA2很可能是通过减轻巨噬细胞浸润来减轻主动脉的AS严重程度,但需进一步的研究证实。

参考文献

[1]Lipoprotein-associated phospholipase A2 and its relationship with markers of subclinical cardiovascular disease:A systematic review[J].Adnan Younus,Choudhry Humayun,Rameez Ahmad,Oluseye Ogunmoroti,Yugandhar Kandimalla,Muhammad Aziz,Rehan Malik,Aisha Rasool Saand,Cyndi Valdes,Rohan Badlani,Muhammad Amir Younus,Shozab S.Ali,Ye Chen,Khurram Nasir.Journal of Clinical Lipidology.2017(2)

[2]Lipoprotein-associated phospholipase A 2 is related to risk of subclinical atherosclerosis but is not supported by Mendelian randomization analysis in a general Japanese population[J].Hirotsugu Ueshima,Takashi Kadowaki,Takashi Hisamatsu,Akira Fujiyoshi,Katsuyuki Miura,Takayoshi Ohkubo,Akira Sekikawa,Aya Kadota,Sayaka Kadowaki,Yasuyuki Nakamura,Naoko Miyagawa,Tomonori Okamura,Yoshikuni Kita,Naoyuki Takashima,Atsunori Kashiwagi,Hiroshi Maegawa,Minoru Horie,Takashi Yamamoto,Takeshi Kimura,Toru Kita.Atherosclerosis.2016

[3]Atherogenesis:hyperhomocysteinemia interactions with LDL,macrophage function,paraoxonase 1,and exercise[J].Ilya Chernyavskiy,Sudhakar Veeranki,Utpal Sen,Suresh C.Tyagi.Annals of the New York Academy of Sciences.2016(1)

[4]Lipoprotein profile,lipoprotein-associated phospholipase A2 and cardiovascular risk in hemodialysis patients.[J].Rolla Roberta,De Mauri Andreana,Valsesia Ambra,Vidali Matteo,Chiarinotti Doriana,Bellomo Giorgio.Journal of nephrology.2015(6)

[5]王凡.有氧运动降低动脉粥样硬化大鼠血清和组织脂蛋白相关磷脂酶A2的水平及意义[D].上海体育学院,2018.