DEAE-DEXTRAN细胞转染试剂盒的应用

背景^[1-3]

DEAE-DEXTRAN细胞转染试剂盒适用于瞬时转染(transient tranfection)，不宜用于筛选稳定表达细胞株，这是因为DEAE-dextran在较高浓度作用较长时间会对细胞产生一定毒性。氯喹的加入可以抑制溶酶体对外源DNA的降解，从而提高转染效率。但对于具体的细胞、具体的培养条件，如需获得更加理想的转染效率，须自行摸索上述各种转染方法，找出优化的转染方法。CHO、DUKX、BⅡ等细胞也可以通过甘油、DMSO进行热休克处理以提高转染效率。

外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖(Dextran)转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。DEAE-葡聚糖转染法的原理是带正电荷的DEAE-葡聚糖不带负电的核酸的磷酸骨架相互作用，形成复合物，该复合物通过细胞内吞噬作用使DNA转导进入细胞核。

DEAE-DEXTRAN细胞转染试剂盒

操作步骤：

1.在转染前24h用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度达50～70%即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。

2.弃培养液，用PBS清洗细胞2次，再用TBS-D buffer清洗1次，吸尽残液。

3.配制转染液:对于6孔板，按照下表依次加入8μl DEAE-Dextran，2μl DNA以及适量的TBS-D，使其总体积为170μl，即为DEAE-Dextran-DNA-TBS-D转染液，用移液器轻轻吹打混匀，但不宜采用离心或Vortex等剧烈方式。

4.转染：把170μl转染液滴加到细胞表面，轻轻晃动6孔板，使其不细胞表面充分接触，37℃孵育20～40min，观察细胞至皱缩变圆为止。

5.缓慢加入1.7ml细胞培养液(约DEAE-Dextran-DNA-TBS-D转染液体积的10倍)。

6.加入17μl Chloroquine solution，亦可和上一步骤中1.7ml细胞培养液预先混合后一起加入。

7.培养不超过2h或在出现明显的细胞毒性前，更换新鲜培养液继续培养，通常转染后48～72小时可以检测转染效果。

应用^[4][5]

用于DJ-1基因慢病毒的构建及耳蜗螺旋神经节细胞转染研究

蒙古沙鼠圆窗膜上滴注不同浓度的哇巴因,建立不同程度耳蜗螺旋神经节细胞（Spiral Ganglion Cells,SGCs）损伤的动物模型;通过该动物模型鼓阶内注入DJ-1基因慢病毒,研究耳蜗SGCs受损后,DJ-1基因慢病毒的转染及其保护作用。方法：①听力正常的雄性蒙古沙鼠随机分成实验组与对照组。对照组沙鼠的右耳圆窗膜上滴注人工外淋巴液0.2ml,实验组沙鼠分成A、B、C三组并在右耳圆窗膜分别滴注浓度为33μM、66μM、80μM总量为0.2ml的哇巴因建立动物模型。

②包装DJ-1基因慢病毒。

③听力正常的蒙古沙鼠随机分为实验组及对照组,对照组沙鼠右耳圆窗膜上滴注人工外淋巴液0.2ml,并于鼓阶注入DJ-1基因慢病毒;实验组沙鼠分成A、B、C三组并于右耳圆窗膜分别滴注浓度为33μM、66μM、80μM总量为0.2ml的哇巴因,每组鼓阶注入DJ-1慢病毒。两周后行Western Blot实验检测DJ-1蛋白质的表达。在蛋白质确切表达的基础上观察DJ-1对于不同程度耳蜗螺旋神经节细胞损伤的修复作用。

结果：形态学观察发现:随着哇巴因浓度的上升,SGCs数量逐渐下降及细胞肿胀,胞浆空泡化,胞核固缩或溶解。Western Blot实验检测到在正常及不同程度SGCs损伤的动物模型中,DJ-1基因慢病毒均有转染,并表达相关蛋白;本实验中不同程度SGCs损伤的动物模型中注射DJ-1慢病毒,较对照组SGCs无增加。

结论：①圆窗膜滴注不同浓度哇巴因可以成功建立不同程度SGCs损伤的动物模型。

②通过293T细胞可以成功包装DJ-1基因慢病毒。

③以慢病毒为载体包装的DJ-1基因可以成功转染SGCs,并表达相应蛋白。

④本实验中不同程度SGCs损伤的动物模型中DJ-1蛋白无神经保护作用。

参考文献

[1]Protocatechuic acid-mediated DJ-1/PARK7 activation followed by PI3K/mTOR signaling pathway activation as a novel mechanism for protection against ketoprofen-induced oxidative damage in the gastrointestinal mucosa[J].Yu-Ting Cheng,Jer-An Lin,Jhih-Jia Jhang,Gow-Chin Yen.Free Radical Biology and Medicine.2018

[2]Intraperitoneal nanotherapy for metastatic ovarian cancer based on siRNA-mediated suppression of DJ-1 protein combined with a low dose of cisplatin[J].Canan Schumann,Stephanie Chan,Jess A.Millar,Yuliya Bortnyak,Katherine Carey,Alex Fedchyk,Leon Wong,Tetiana Korzun,Abraham S.Moses,Anna Lorenz,Delany Shea,Olena Taratula,Oleh Khalimonchuk,Oleh Taratula.Nanomedicine:Nanotechnology,Biology,and Medici.2018(4)

[3]Audiological Profile of Adult Persons with Auditory Neuropathy Spectrum Disorders.[J].Yuvaraj Pradeep,Jayaram Mannarukrishnaiah.Journal of audiology＆otology.2016(3)

[4]Auditory nerve disease and auditory neuropathy spectrum disorders[J].Kimitaka Kaga.Auris Nasus Larynx.2015

[5]方浩.DJ-1基因慢病毒的构建及耳蜗螺旋神经节细胞转染研究[D].昆明医科大学,2019.