人透明质酸酶(HAASE)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人透明质酸酶(HAASE)ELISA试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中透明质酸酶(HAASE)的含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人透明质酸酶（HAase）水平。用纯化的人透明质酸酶（HAase）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入介素2（IL-2），再与HRP标记的介素2（IL-2）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的介素2（IL-2）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人透明质酸酶（HAase）浓度。

人透明质酸酶(HAASE)ELISA试剂盒

操作步骤

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在*、第二孔中分别加标准品100μl，然后在*、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从*孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于重组人透明质酸酶PH-20在毕赤酵母中的表达，发酵条件优化及性质研究

利用基因工程技术将人ph-20基因转入P.pastoris,制备重组人透明质酸酶PH-20（rhPH-20）,可以提高药物安全性,降低生产成本,减少治疗费用。

实验方法：将人类ph-20基因进行优化合成,并在两端引入酶切位点XhoⅠ/XbaⅠ,得到克隆质粒pUC57-ph20。再利用双酶切将ph-20基因插入带有AOX启动子和α-信号肽的高效表达载体pPICZa A的多克隆位点,构建pPICZαA-ph20重组质粒,CaCl2法转化E.coli TOP 10进行大量扩增,提取质粒。质粒经酶切、PCR扩增和DNA序列分析鉴定阳性克隆。

阳性重组质粒经SacⅠ线性化后,电击转化导入P.pastoris SMD1168H,使基因整合到酵母染色体上。抗生素Zeocin浓度梯度筛选多拷贝菌株。鉴定菌株表型,筛选出甲醇利用型Mut+。对重组菌株进行摇瓶表达,分别经YPD、BMGY、BMMY培养基培养,0.5%甲醇诱导表达。

对表达产物中的粗酶进行活性测定,上清液进行SDS-PAGE。分别采用DNS法、DMAB法、浊度法测定样品活性,并对结果进行分析比较,选择方法。筛选产量与活性都较高的重组菌作为工程菌株,1 L发酵罐中甲醇诱导表达rhPH-20,并对发酵条件进行优化,先以甘油为碳源,细胞湿重达200g/L以上时开始甲醇诱导。发酵液离心后上清液进行超滤,浓缩并脱盐。

对rhPH-20的部分酶学性质进行研究。结果与结论人类ph-20基因片段全长2009bp,其ORF为1533 bp,编码511个氨基酸,包含信号肽序列（1～35）和疏水锚定区（484～511）。由于基因自身信号肽分泌效果较差,锚定区使蛋白质不溶,我们将这两部分去掉,只选择中间的448个氨基酸序列进行优化并合成,理论Mr为51 kDa。

将其插入高效表达载体成功构建pPICZa A-ph20重组表达质粒,首次实现了人ph-20基因在P.pastoris中的表达。抗生素Zeocin浓度梯度筛选多拷贝菌株,最高抗Zeocin浓度为4.5 mg/mL,筛选Mut+表型。通过SDS-PAGE对重组蛋白进行分析,得出Mr约为58 kDa,这是由于糖基化作用,实际Mr比理论Mr大。DNS法与DMAB法的线性范围分别是50～450 U/mL、50-350 U/mL。浊度法的线性范围较小,为0～10 U/mL。

3种方法的RSD分别是2.71%、11.71%和0.65%。DNS法适于测定酶活性较高的样品,浊度法适合酶活性较低的样品。摇瓶培养诱导前菌体密度A600=4,甲醇浓度为0.5%,表达时间72 h,最高酶活性达1×104U/L。利用1 L发酵罐对发酵条件优化,诱导前最适菌体量为200g/L,诱导pH为6.0,流加甘油速率控制在0.32 mL/（L-min）,流加甲醇速率为0.13 mL/（L-min）,溶氧维持在20%以上,诱导68 h后酶活达到最高值6×105U/L,总蛋白质表达量为0.307mg/mL,比活为1.954×103U/mg,目的蛋白质占胞外总蛋白质的38%。

参考文献

[1]Cloning and optimized expression of a neutral endoglucanase gene（ncel5A）from Volvariella volvacea WX32 in Pichia pastoris[J].Jianfang Li,Cunduo Tang,Hongling Shi,Minchen Wu.Journal of Bioscience and Bioengineering.2011(5)

[2]Molecular cloning,expression and characterization of the functional domain of CTLA4 from the rhesus monkey,Macaca mulatta[J].Shengyun Zhu,Shan Liu,Lin Wan,Guang Yang,Hao Yang,Jingqiu Cheng,Xiaofeng Lu.Developmental and Comparative Immunology.2011(7)

[3]Expression of Apostichopus japonicus lysozyme in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Tingting Wang,Yongping Xu,Wenjia Liu,Yongxin Sun,Liji Jin.Protein Expression and Purification.2011(1)

[4]Extravasation Management:Clinical Update[J].Lisa Schulmeister.Seminars in Oncology Nursing.2011(1)

[5]王晓玉.重组人透明质酸酶PH-20在毕赤酵母中的表达，发酵条件优化及性质研究[D].山东大学,2011.