人胃泌素释放肽前体(PROGRP)ELISA 试剂盒的应用

背景^[1-3]

人胃泌素释放肽前体(PROGRP)ELISA试剂盒可以在体外定量测定血浆、组织匀浆和其他生物液体中的人胃泌素释放肽前体(ProGRP)浓度。

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

人胃泌素释放肽前体(PROGRP)ELISA试剂盒

样品收集、处理及保存方法

1.血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于抗胃泌素释放肽前体ProGRP31-98单克隆抗体的实验研究

1．了解胃泌素释放肽（gastrin-releasing peptide GRP）在小细胞肺癌细胞株及组织中的表达率及表达位置。

2．研究抗胃泌素释放肽前体(pro-gastrin-releasing peptide31-98ProGRP31-98)单克隆抗体E-B5的131I标记方法、131I-E-B5的稳定性及标记后抗体免疫活性。

3．研究131I-E-B5在正常昆明小鼠及小细胞肺癌荷瘤裸鼠体内的分布情况，探讨131I-E-B5的体内药代动力学过程。

4．研究131I-E-B5对不同类型肿瘤的显像效果及显像时间。

5．探讨131I-E-B5放射免疫治疗小细胞肺癌的可行性及其疗效。

研究方法1．采用流式细胞仪检测小细胞肺癌NCI-H446细胞株及肺腺癌A549胞株中GRP表达情况，通过免疫组化法检测人小细胞肺癌组织中GRP的表达情况。

2．E-B5的131I标记采用氯胺-T法，通过纸层析法检测标记率、放化纯，将131I-E-B5置于37℃水浴箱及与正常人血清混合后在不同时间点测定放化纯以了解其稳定性，利用细胞结合分析法测定131I-E-B5的免疫活性。

3．自昆明小鼠尾静脉注射131I-E-B5后不同时间点断颈动脉处死小鼠，同时取血液及各主要脏器组织，计算各时间点的％ID／g及药物动力学参数。建立人小细胞肺癌荷瘤裸鼠模型，自荷瘤裸鼠尾静脉注射131I-E-B5后不同时间点处死裸鼠并取各主要脏器组织，计算各时间点的％ID／g和T／NT值。

4．分别对荷小细胞肺癌、肺腺癌和大肠癌裸鼠模型进行131I-E-B5显像，观察移植瘤的显影情况并计算瘤体与对侧相同部位的T／B比值。

5．治疗实验采用瘤内注射方式，根据治疗剂量的不同，将小细胞肺癌荷瘤裸鼠随机分为未处理组、131I-E-B5治疗组和Na131I对照组，动态观察裸鼠及移植瘤生长情况，测量不同时间瘤体的大小，计算抑制率并绘制肿瘤生长曲线。

研究结果1．GRP在NCI-H446和A549细胞株中的表达率分别为89％、12％；免疫组化检测见人小细胞肺癌组织切片中有明显的E-B2阳性细胞分布，并显示棕黄色颗粒在肿瘤细胞的细胞浆内。

2．131I-E-B5标记率为90．8％，放化纯为99．28％，放射性比活度为2．69MBq／μg；在37℃水浴箱放置6h后131I-E-B5放化纯高达90％，24h后仍大于70％；和正常人血清充分混合24小时后131I-E-B5放化纯达68．1％。；131I-E-B5对NCI-H446和A549细胞株的免疫结合率分别为71．6％、33．2％。

3．131I-E-B5在正常昆明小鼠的体内过程符合一级血药动力学二室模型，主要通过肝脏、肾脏代谢，血液清除速度较快。注射后48h移植瘤体的％ID／g显著高于其它脏器及组织，72h时达到最高值，T／NT比值随时间延长而逐渐升高。

4．注射后24h小细胞肺癌荷瘤裸鼠移植瘤部位明显聚集131I-E-B5，随时间延长移植瘤部位放射性浓聚程度逐渐增强，72h和96h时最为清晰。肺腺癌荷瘤裸鼠移植瘤部位未见明显131I-E-B5聚集。大肠癌荷瘤裸鼠显像结果和小细胞肺癌荷瘤裸鼠显像结果类似，但肉眼观察移植瘤部位浓聚131I-E-B5程度低于小细胞肺癌荷瘤裸鼠。小细胞肺癌各时相点的T／B值均明显高于大肠癌，两者均明显高于肺腺癌裸鼠模型，而肺腺癌裸鼠模型的T／B比值没有明显的变化。

5．131I-E-B5治疗组的肿瘤抑制率明显大于Na131I组。131I-E-B5治疗2周后移植瘤开始明显缩小，瘤体表面出现明显的点状破溃、坏死并逐渐扩大，4周后100μCi和200μCi剂量组仍可见杯状的溃疡灶，而400μCi和600μCi剂量组的肿瘤几乎全部消失。131I对照组移植瘤生长缓慢，但瘤体在观察期内无明显的缩小，仅在400μCi和600μCi剂量组的肿瘤表面出现点状的破溃坏死。

参考文献

[1]Targeted determination of the early stage SCLC specific biomarker pro‐gastrin‐releasing peptide（ProGRP）at clinical concentration levels in human serum using LC‐MS[J].PetterMoi,ElisabethPaus,J.Léon E.Reubsaet.J.Sep.Science.2007(16)

[2]Determination of the small cell lung cancer associated biomarker pro‐gastrin‐releasing peptide（ProGRP）using LC‐MS[J].Jan LéonReubsaet.J.Sep.Science.2007(2)

[3]Comparison of Neurone-specific Enolase and Pro-gastrin Releasing Peptide in the Prognostic Evaluation of Small Cell Lung Cancer Patients[J].H.Satoh,K.Kagohashi,K.Kurishima,H.Ishikawa,M.Ohtsuka.Clinical Oncology.2006(9)

[4]A Small Cell Carcinoma of the Pancreas with a High Level of Serum ProGRP[J].Hiroyuki Matsubayashi,Shinichi Fujiwara,Yuka Kobayashi,Takao Iiri,Anirban Mitra,Michael Goggins,Ralph H Hruban,Fuminori Moriyasu.Journal of Clinical Gastroenterology.2004(9)

[5]徐巧玲.抗胃泌素释放肽前体ProGRP_（31-98）单克隆抗体的实验研究[D].苏州大学,2008.