人抗天然脱氧核糖核酸抗体(N-DNA-AB)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗天然脱氧核糖核酸抗体(N-DNA-AB)ELISA试剂盒用于血清血浆，尿液，组织匀浆，细胞上清液，脑脊液等相关液体中抗天然脱氧核糖核酸抗体(N-DNA-AB)的含量检测。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定样品指标水平。样品包括血清血浆尿液脑脊液细胞固体组织等，用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入样品，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中浓度，或者与CUTOFF值相比较，从而判定标本阴阳性。

人抗天然脱氧核糖核酸抗体(N-DNA-AB)ELISA试剂盒

标本要求

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤

1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3. 样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于恶性疟原虫中含EEP结构域的DNase的表达与功能鉴定研究

在人体内无性生殖阶段中,疟原虫大量复制和反复入侵红细胞造成了疟疾的发病。脱氧核糖核酸酶（DNase）是参与生物体DNA复制、修复和重组等生理活动的重要蛋白质,同时也在病原体免疫逃避过程中发挥重要功能。EEP结构域能够水解DNA中的磷酸二酯键,是DNase降解DNA发挥功能的结构域之一。

恶性疟原虫PF3D71238600、PF3D70107200、PF3D70305600、PF3D70319200和PF3D71363500蛋白质预测含有EEP结构域,且未见相关研究报道。首先,以Seryl-t RNA合成酶基因为内参基因,利用荧光定量PCR技术分析了PF3D71238600、PF3D70107200、PF3D70305600、PF3D71363500和PF3D70319200基因在恶性疟原虫3D7株红细胞内期不同发育阶段的转录情况,并比较了目的基因之间的转录水平。

结果显示目的基因在恶性疟原虫3D7株整个红内期全程转录,并在滋养体和裂殖体期达到高峰;目的基因间转录差异较大,其中PF3D71238600基因整体转录水平最高,PF3D70107200基因整体转录水平最低。然后,通过对目的DNase氨基酸序列的亲水性分析,选取亲水好的区域进行重组蛋白质的原核表达与纯化,并免疫家兔制备多克隆抗体。

以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blot检测虫体天然蛋白的表达,用间接免疫荧光对虫体天然蛋白质进行定位。结果显示,目的DNase在恶性疟原虫3D7株红细胞内期均有表达。间接免疫荧光分析显示,PF3D70319200蛋白质定位于细胞核,PF3D71238600、PF3D70305600和PF3D71363500蛋白质定位于细胞核周围,PF3D70107200蛋白质定位于细胞质。进一步将目的DNase的EEP结构域进行原核表达,进行体外DNA降解实验以确定其DNase活性。

结果显示,PF3D71363500和PF3D70107200蛋白质为非金属离子依赖性脱氧核糖核酸内切酶,PF3D70305600和PF3D70319200蛋白质为Mg2+/Mn2+依赖性脱氧核酸酶内切酶,PF3D71238600蛋白质为Cu2+依赖性脱氧核糖核酸酶外切酶。

参考文献

[1]Malaria:[J] . Behzad Nadjm,Ron H. Behrens.  Infectious Disease Clinics of North America . 2012 (2)

[2]The cellular and molecular basis for malaria parasite invasion of the human red blood cell[J] . Alan F. Cowman,Drew Berry,Jake Baum.  The Journal of Cell Biology . 2012 (6)

[3]Specific cleavage of the DNase‐I binding loop dramatically decreases the thermal stability of actin[J] . Anastasia V.Pivovarova,Sofia Yu.Khaitlina,Dmitrii I.Levitsky.  FEBS Journal . 2010 (18)

[4]Invasion of Red Blood Cells by Malaria Parasites[J] . Alan F. Cowman,Brendan S. Crabb.  Cell . 2006 (4)

[5]土志伟. 恶性疟原虫中含EEP结构域的DNase的表达与功能鉴定[D].吉林大学,2016.