CACO-2细胞专用培养基的应用

背景^[1-3]

CACO-2细胞专用培养基经过长期测试，可保持Caco-2细胞的生长状态。本产品中已包含Caco-2细胞生长所需的各种成分，无需添加任何成分，可直接用于Caco-2细胞的体外培养。产品仅供进一步科研使用，不得用于诊断、治疗、临床、家庭及其它用途。

CACO-2细胞专用培养基成分;MEM＋20%FBS＋1%P/S。

CACO-2细胞

CACO-2细胞分离自一位72岁男性直肠原位癌，人结肠癌Caco-2细胞系在标准培养条件下汇合后，自发分化为肠上皮样细胞，是常用的肠癌细胞模型。

生长特性

1. 呈岛状生长;Caco-2细胞群的边界光滑，视野中一个个细胞克隆如同海上小岛一般。

2. 空泡多;Caco-2细胞群中常常含有巨大的空泡，这是细胞本身的特性，属于正常现象。

3. 难消化;Caco-2细胞与细胞间连接紧密，使得细胞难以解离。通常加入胰酶后，细胞克隆的四周先飘起来，中间仍贴壁；随后整片克隆脱落，但细胞与细胞间不会分散。消化时间为5-10分钟，该细胞难以被吹散为单个细胞，当细胞能够被吹散为小的细胞团块，即可终止消化。

4. 贴壁慢;Caco-2贴壁缓慢，在标准培养条件MEM（含NEAA）＋20%FBS＋1%P/S】下，接种后约24~72小时完成贴壁。推荐接种后第三天再换液。

5. 生长慢;Caco-2细胞传代周期较长，这是因为Caco-2贴壁和生长都较为缓慢。按1:4传代的情况下，约一周传代一次。

应用^[4][5]

用于基于Caco-2细胞与小鼠肠道模型的微塑料生物毒性效应研究

通过体外实验和体内实验研究微塑料对肠道的影响。体外实验主要研究20、200 nm聚苯乙烯（Polystyrene,PS）对Caco-2细胞的毒性机制。体内实验方面,将过1000目筛的聚苯乙烯（PS）、聚乙烯（polyethylene,PE）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate,PET）、聚氯乙烯（Polyvinyl chloride,PVC）、尼龙66（Polyadiohexylenediamine,PA66）对C57BL/6小鼠进行灌胃,每种塑料设置两个剂量组（3,30 mg微塑料/kg体重）,研究不同种类微塑料对小鼠血清脂代谢、肠道免疫以及肠道菌群变化的影响。

具体研究内容与结果如下:1.20 nm PS（PS20）、200 nm PS（PS200）与Caco-2细胞共培养6 h后,PS20浓度为80μg/m L时细胞活力显著下降,PS200浓度在100μg/m L时微观察到细胞活力的显著变化。活性氧（ROS）水平、乳酸脱氢酶（LDH）释放、谷胱甘肽（GSH）测定结果表明PS20和PS200对Caco-2细胞毒性影响呈浓度依赖性,并且PS20对细胞的影响大于PS200。通过免疫荧光实验观察到PS进入细胞的溶酶体,同时发现大量的PS20与线粒体发生共定位。应用JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位,结果显示PS20诱导细胞发生严重的线粒体膜电位去极化,致使细胞发生凋亡。流式细胞实验结果与线粒体膜电位检测结果一致,PS20浓度为20μg/m L的时候诱导细胞发生早期凋亡,PS20浓度达80μg/m L时诱导细胞发生晚期凋亡。

2. 选取6周周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分组后使用微塑料连续对小鼠灌胃4周。PET、PVC、PA66小鼠体重显著下降。PS、PE、PET、PVC、PA66处理对小鼠肝系数、肾系数、脾系数无显著影响,但引起了血清中总甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的代谢紊乱。

3. 基于宿主基因表达,分析回肠与结肠黏蛋白基因（MUC2、MUC3）、微生物识别受体（TLR2、TLR4、NOD2）、调节因子（Fox P3、GPR43）、炎性细胞因子（IL-10）以及转化生长因子（TGF-β）的转录水平,以确定不同种类微塑料对肠道的影响。本研究所用的5种微塑料对回肠TLR2、TLR4、NOD2转录水平的下调作用普遍大于结肠。各实验组处理后出现的Fox P3、IL-10、TGF-β转录水平下调说明微塑料具有损伤肠道免疫功能的潜力。

4.通过16S rRNA高通量测序,研究不同种类微塑料对小鼠肠道菌群的影响。结果表明,PS、PE、PET、PVC、PA66改变了小鼠肠道微生物的Alpha多样性与Beta多样性,显著降低了乳杆菌属的相对丰度。灌胃时间达4周后,小鼠肠道中厚壁菌门的相对丰度显著降低。在种水平上,高剂量PS、PET、PVC、PA66组显著增加了Akkermansia＿muciniphila的相对丰度。

参考文献

[1]Reaching New Heights in Plastic Pollution—Preliminary Findings of Microplastics on Mount Everest[J].Napper Imogen E.,Davies Bede F.R.,Clifford Heather,Elvin Sandra,Koldewey Heather J.,Mayewski Paul A.,Miner Kimberley R.,Potocki Mariusz,Elmore Aurora C.,Gajurel Ananta P.,Thompson Richard C..One Earth.2020(5)

[2]Different effects of nano-and microplastics on oxidative status and gut microbiota in the marine medaka Oryzias melastigma[J].Kang Hye Min,Byeon Eunjin,Jeong Haksoo,Kim Min Sub,Chen Qiqing,Lee Jae Seong.Journal of Hazardous Materials.2020(prep)

[3]Bioavailability of Microplastics to Marine Zooplankton:Effect of Shape and Infochemicals.[J].Botterell Zara L R,Beaumont Nicola,Cole Matthew,Hopkins Frances E,Steinke Michael,Thompson Richard C,Lindeque Penelope K.Environmental science＆technology.2020

[4]Effects of bisphenol A and nanoscale and microscale polystyrene plastic exposure on particle uptake and toxicity in human Caco-2 cells[J].Qiangqiang Wang,Jialei Bai,Baoan Ning,Longxing Fan,Tieqiang Sun,Yanjun Fang,Jin Wu,Shuang Li,Chenhui Duan,Yingchun Zhang,Jun Liang,Zhixian Gao.Chemosphere.2020(prep)

[5]陆子凡.基于Caco-2细胞与小鼠肠道模型的微塑料生物毒性效应研究[D].广东海洋大学,2021.