人细胞周期素D2(CYCLIN-D2)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人细胞周期素D2(CYCLIN-D2)ELISA试剂盒用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内细胞周期素D2(CYCLIN-D2)的含量检测。

实验原理：人细胞周期素D2(CYCLIN-D2)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被人细胞周期素D2(Cyclin-D2)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人细胞周期素D2(Cyclin-D2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人细胞周期素D2(CYCLIN-D2)ELISA试剂盒

操作步骤:

1.标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

6.加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

7.温育:操作同3。

8.洗涤:操作同5。

9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.

10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11.测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于‘741杨’D2类细胞周期蛋白基因PtoCYCD2的克隆与功能研究

文以‘741杨’为研究材料,克隆得到两个D2类Cyclin基因:PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2,利用序列搜索及比对、系统进化分析、表达模式分析、蛋白定位分析和遗传转化等方法分析其生物学功能,研究杨树细胞周期蛋白调控细胞分裂的相关信号通路,主要结果如下:（1）PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因的c DNA包含1062和1041 bp开放阅读框,分别编码353和346个氨基酸。蛋白质结构域分析、系统进化分析、多序列比对和PEST预测等数据鉴定出这两个CYCD2基因属于D2类Cyclin。序列分析显示PtoCYCD2;1基因含有6个外显子,PtoCYCD2;2基因含有7个外显子,且在Cyclin＿C结构域中存在较多的单氨基酸突变。三维结构模拟显示两个蛋白在Loop区存在差异。这预示着PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因可能存在功能差异。

（2）组织表达模式分析表明PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因在根、茎、叶、叶柄、木质部和树皮中均有表达,在叶中的相对表达水平最高。将PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2蛋白与绿色荧光蛋白连接,并在烟草中瞬时表达重组蛋白,发现这两个蛋白定位于细胞核,在细胞核内行使生物学功能。

（3）与野生型（wild-type poplar,WT）相比,过表达PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因的‘741杨’出现株高降低,茎粗减小,叶片明显向远轴面方向卷曲的表型。扫描电镜分析（scanning electron microscope,SEM）显示在相同表面积内,转基因杨树叶片的上表皮细胞较WT平均面积变小,数量增多,形态不规则。树脂切片结果显示与WT相比,转基因杨树叶片的栅栏组织的细胞变短,海绵组织的细胞间隙疏松,叶片的背腹发育发生改变;且茎节的木质部呈现不同程度的减少,木质部发育受到影响。实时定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR）结果表明转基因杨树中细胞周期蛋白依赖性激酶基因CDKA;1、CDKB1;1和CDKB2;1的表达水平显著上调,植物成视网膜细胞瘤相关蛋白1（retinoblastoma-related protein1,RBR1）基因、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（kip-Related Protein,KRP）基因表达水平显著下调。

（4）对过表达PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因的‘741杨’进行形态学测定发现,两者在植物高度、茎粗、木质部及对部分细胞周期调节蛋白基因（KRP5）的调控方面存在显著差异,说明PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因在‘741杨’生长发育中出现功能差异。

参考文献

[1]Downregulation of multiple CDK inhibitor ICK/KRP genes upregulates the E2F pathway and increases cell proliferation,and organ and seed sizes in Arabidopsis[J].Yan Cheng,Ling Cao,Sheng Wang,Yongpeng Li,Xianzong Shi,Han Liu,Lixia Li,Zhengli Zhang,Larry C.Fowke,Hong Wang,Yongming Zhou.Plant J.2013(4)

[2]Genetic Framework of Cyclin-Dependent Kinase Function in Arabidopsis[J].Moritz K.Nowack,Hirofumi Harashima,Nico Dissmeyer,Xin’Ai Zhao,Daniel Bouyer,Annika K.Weimer,Freya De Winter,Fang Yang,Arp Schnittger.Developmental Cell.2012(5)

[3]The Emerging Importance of Type I MADS Box Transcription Factors for Plant Reproduction[J].Masiero,Simona,Colombo,Lucia,Grini,Paul E,Schnittger,Arp,Kater,Martin M.EN.2011(3)

[4]The Arabidopsis D-Type Cyclin CYCD2;1 and the Inhibitor ICK2/KRP2 Modulate Auxin-Induced Lateral Root Formation（C）（W）（OA）[J].Sanz,Luis,Dewitte,Walter,Forzani,Celine,Patell,Farah,Nieuwland,Jeroen,Wen,Bo,Quelhas,Pedro,De Jager,Sarah,Titmus,Craig,Campilho,Aurélio,Ren,Hong,Estelle,Mark,Wang,Hong,Murray,James A H.Plant Cell.2011(2)

[5]刘孝晨.‘741杨’D2类细胞周期蛋白基因PtoCYCD2的克隆与功能研究[D].北京林业大学,2020.