人DNA甲基化转移酶2(DNMT2)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人DNA甲基化转移酶2(DNMT2)ELISA试剂盒运用双抗体夹心ELISA酶联免疫法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体样本中PCDH1含量。

实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人DNA甲基化转移酶（DNMT）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人DNA甲基化转移酶（DNMT）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人DNA甲基化转移酶2(DNMT2)ELISA试剂盒

样本制备及注意事项：

1.细胞培养上清：2000-3000转/分离心20分钟后取上清；

2.组织匀浆：切割标本后，称重，按1：生理盐水匀浆，5000转/分离心3-5分钟后取上清；

3.血清：样本室温放置2小时或4℃过夜后取上清；

4.血浆：可用EDTA、枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂（根据试剂盒要求选择），样本加入10%抗凝剂混合10-20分钟，2000-3000转/分离心20分钟后取上清；

5.尿液、胸水、腹水、脑积液等：2000-3000转/分离心20分钟后取上清。

操作步骤：

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照随货说明书中图表在小试管中进行稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于甲壳动物DNA甲基转移酶2（Dnmt2）基因的分子特征、表达分析及DNA甲基化水平检测研究

以甲壳动物卤虫Artemia franciscana和罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii为研究对象，通过对Dnmt2基因的表达分析以及DNA甲基化水平的测定，阐明了Dnmt2基因的表达变化与卤虫和罗氏沼虾的胚胎发育有着密切的关系，但与DNA甲基化水平没有明显的相关性。

本研究为Dnmt2基因在甲壳动物中功能的研究奠定了基础，其结果主要包括以下三个方面：1．采用CODEHOP兼并引物方法，在甲壳动物卤虫和罗氏沼虾中分离得到Dnmt2基因，并各自命名为AfDnmt2和MarDnmt2。我们获得的AfDnmt2 cDNA长度为1054-bp，包含了一个1140-bp长度的开放式阅读框（open reading frame，ORF）。此开放式阅读框编码379个氨基酸残基；MarDnmt2 cDNA全长为1472-bp，包含一个1191-bp长度的开放式阅读框，此开放式阅读框编码编码396个氨基酸残基。AfDnmt2和MarDnmt2各自编码的蛋白质与其它种类Dnmt2相比，均呈现出30％—40％的相似性、十个DNA甲基转移酶特征性的模体，以及一个目标识别域（target recognized domain，TRD）。这是首次在甲壳动物中报道Dnmt2基因，也是现今已知的唯一的甲壳动物Dnmt基因。并且，采用PCR和Southern Blotting方法，对AfDnmt2在基因组上的结构进行分析，结果表明，AfDnmt2在基因组上不存在内含子，并且以多拷贝形式存在于卤虫基因组中。

2．采用半定量RT-PCR分析方法，检测AfDnmt2在卤虫休眠卵发育过程中的表达。结果显示，在卤虫休眠囊胚的孵化过程中，AfDnmt2 mRNA水平表现出明显的上升趋势，当休眠囊胚孵化10小时时，AfDnmt2 mRNA水平达到最高。接着，伴随着卤虫无节幼体的出现，AfDnmt2水平呈现明显的下降；对幼虫和成虫的AfDnmt2表达水平检测中发现，幼虫L7时期到幼虫L12时期，AfDnmt2 mRNA有一明显的下降过程。成熟的雌性卤虫与雄性卤虫之间，AfDnmt2 mRNA水平未出现较大的差异。采用C~5-甲基胞嘧啶抗体检测方法，对卤虫的基因组DNA甲基化水平进行测定。结果发现，卤虫DNA甲基化水平约为0.02％，AfDnmt2基因的表达变化与DNA甲基化水平没有明显的相关性。

3．采用荧光定量PCR的方法，对罗氏沼虾MarDnmt2进行表达特征研究，结果表明，MarDnmt2在罗氏沼虾的各个组织中均能检测到其表达，但是，卵巢组织中的MarDnmt2 mRNA水平最高，约是其它组织的5-16倍，呈现出组织特异性的表达方式。进一步对罗氏沼虾的胚胎发育过程研究发现，MarDnmt2 mRNA水平与罗氏沼虾胚胎发育有着密切的关系。即随着卵巢的发育，MarDnmt2 mRNA水平逐步上升，到卵巢最成熟时期，其表达量达到最高。

参考文献

[1]Regularized logistic regression with adjusted adaptive elastic net for gene selection in high dimensional cancer classification[J].Zakariya Yahya Algamal,Muhammad Hisyam Lee.Computers in Biology and Medicine.2015

[2]Dnmt3a and Dnmt3b Have Overlapping and Distinct Functions in Hematopoietic Stem Cells[J].Grant A.Challen,Deqiang Sun,Allison Mayle,Mira Jeong,Min Luo,Benjamin Rodriguez,Cates Mallaney,Hamza Celik,Liubin Yang,Zheng Xia,Sean Cullen,Jonathan Berg,Yayun Zheng,Gretchen J.Darlington,Wei Li,Margaret A.Goodell.Cell Stem Cell.2014(3)

[3]Investigation of the expression patterns and correlation of DNA methyltransferasesand class I histone deacetylases in ovarian cancer tissues[J].Yifeng Gu,Peifang Yang,Qing Shao,Xia Liu,Sheng Xia,Miaomiao Zhang,Huaxi Xu,Qixiang Shao.Oncology Letters.2013(2)

[4]DNA Demethylation and USF Regulate the Meiosis-Specific Expression of the Mouse Miwi[J].Yu Hou,Jia Yuan,Xiang Zhou,Xiazhou Fu,Hanhua Cheng,Rongjia Zhou.PLOS Genetics.2012(5)

[5]冯琛卓.甲壳动物DNA甲基转移酶2（Dnmt2）基因的分子特征、表达分析及DNA甲基化水平检测[D].浙江大学,2007.