慢病毒包装试剂盒的应用

背景^[1-3]

慢病毒包装试剂盒包括优化的慢病毒包装辅助质粒混合物（GM easyTM Lentiviral Mix）、表达eGFP蛋白的对照质粒和高效转染试剂（HG TransgeneTM Reagent），可以兼容第二代和第三代的慢病毒包装质粒，其优势在于慢病毒包装时间周期短（一周之内即可拿到纯化好的高滴度慢病毒）、病毒，可应用于针对不同基因和药物靶标的临床前细胞学实验和整体动物实验。

慢病毒载体表达系统由pGMLV慢病毒载体和Lentiviral Mix质粒组成。pGMLV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WPRE和cPPT/CTS等。翌圣可以根据不同的实验目的针对pGMLV载体改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、RNA干扰等研究。Lentiviral Mix能够表达病毒包装需要的各种必需成分如：gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子；还含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白，可以兼容第二代和第三代的慢病毒包装质粒。

慢病毒包装试剂盒

制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其辅助包装原件载体质粒，重组质粒载体和辅助质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，使用HG TransgeneTM Reagent进行共转染293T细胞，转染后8 h更换为完全培养基，培养48 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定病毒滴度。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。

1)293T细胞分盘：转染前一天，将已经长好的细胞以合适比例传代到10 cm培养皿中，当细胞长到~80%时准备转染。

2)转染前换液：转染前1~2 h将需要转染的细胞换新鲜的培养基，12 mL/10 cm皿。注意：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞。

3)转染：取无菌的1.5 mL EP管或15 mL离心管，MIX混匀后，室温放置18 min~20 min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。

4)换液：转染18~20 h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中（注意：此时培养基中已含有少量的病毒，必须经处理后才能丢弃，所用的移液枪头等必须经消毒液浸泡处理后才能丢弃），然后加15 mL新鲜的培养基（也可根据实验要求换为无血清的DMEM）继续培养。

5)病毒收集：换液48 h后，吸取细胞上清液于50 mL离心管，4℃，500 g离心5 min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时上清液中的病毒颗粒可以直接去检测滴度或者感染目的细胞，如果对病毒的滴度及纯度有较高要求，可对上清液进行浓缩与纯化。

6)病毒分装与保存：将病毒以40~50μL分装，后保存于-80℃。

应用^[4][5]

用于CTLA-4真核表达载体的构建及其慢病毒包装研究

通过分子生物学方法构建CTLA-4真核表达载体并对其进行慢病毒包装,为探讨CTLA-4是否在糖尿病相关性胰腺癌的发生发展中起到作用提供有效的生物学工具。方法:通过PubMed查询并由Primers5软件设计Luciferase引物,该引物含有Eco RI和NOT I双酶切位点,经PCR扩增引物后,扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪上观察凝胶电泳图谱。

之后将扩增的目的片段与载体经双酶切后,回收酶切产物,再行琼脂糖凝胶电泳,胶回收纯化双酶切产物后,用T4 DNA酶将目的基因与质粒进行重组,构建出重组质粒pCAG-3Flag-Luciferase-IRES-mcherry。

将重组质粒转化感受态后行阳性克隆鉴定,用无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒。将提取的重组质粒行基因测序鉴定目的基因片段是否连接正确。同理构建重组质粒pCAG-CTLA4-3Flag-Luciferase-IRES-mcherry。将上述测序正确的重组质粒进行慢病毒包装后,转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染后重组质粒的表达情况。

结果:设计出Luciferase引物后,经PCR扩增引物、琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增出与gene bank公布的DNA片段大小相符的目的基因片段,表明成功扩增片段为Luciferase基因片段,经Eco R I/NOTⅠ双酶切分析、重组、菌落PCR和基因测序发现pCAG-3Flag-Luciferase-IRES-mcherry构建成功。同样的方法成功构建出pCAG-CTLA4-3Flag-Luciferase-IRES-mcherry。对两类重组质粒进行慢病毒包装,转染至293T细胞,荧光显微镜观察转染的细胞,细胞被激发出红色荧光,说明成功的完成了对两类重组质粒的慢病毒包装。

参考文献

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[3]MicroRNA-301a promotes pancreatic cancer invasion and metastasis through the JAK/STAT3 signaling pathway by targeting SOCS5.[J].Hu Hui,Zhang Qin,Chen Weiqun,Wu Tangwei,Liu Shuiyi,Li Xiaoyi,Luo Bo,Zhang Tianzhu,Yan Ge,Lu Hongda,Lu Zhongxin.Carcinogenesis.2020(4)

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[5]陈旭.CTLA-4真核表达载体的构建及其慢病毒包装[D].内蒙古医科大学,2021.