磁珠法 PCR 产物纯化试剂盒的应用

背景^[1-3]

磁珠法PCR产物纯化试剂盒是在生工磁珠法PCR产物纯化试剂盒的基础上进行改进、一次可同时处理96个不同样品的试剂盒。该试剂盒利用磁性纳米分离技术从PCR反应产物及其他酶促反应物中,提取纯化高质量DNA,操作简单、快速,并能有效的除去蛋白质,dNTP,引物等杂质,适用于自动化核酸纯化平台,纯化后的DNA可以应用到各类下游分子生物学实验。

实验原理：样品中的DNA与磁珠特异性结合，在外界磁场(如磁分离架)的作用下，磁珠与相应溶液可以快速而高效地分离，经洗涤充分除杂质，最后用洗脱液将DNA从磁珠上洗脱下来，即可获得高度纯化的DNA样品。

磁珠法PCR产物纯化试剂盒

本试剂盒具有效果稳定、纯度好、操作灵活便捷、可纯化DNA片段大小范围广等优点。根据实际状况灵活调节磁珠用量，通常15分钟内即可完成纯化。适用于100bp以上DNA片段的纯化，对达到10kb片段DNA的纯化也能保持较好的效果，对长至30个碱基的引物可被完全去除。通常回收率达到90%以上。本试剂盒也适用于低浓度样品的浓缩。

目前DNA纯化的方法主要为柱纯化试剂盒法。该方法通常需要反复离心，或者需要特殊的抽滤装置，而且柱纯化过程中的纤维切割对大片段DNA回收不太有利。而磁珠法条件温和，整个操作步骤无需繁琐的反复离心或抽滤操作，而以简单的磁铁吸附所代替，因而确保了操作的快速和便捷。

应用^[4][5]

用于镇雄王姓mtDNA HVI多态性研究及法医学应用研究

为获取镇雄王姓家系个体mtDNA HVI多态信息,为其在法医学实践应用提供群体遗传学数据;毛干模板DNA提取、HVI扩增和测序的优化方法,以提高此类检材的检出率。

[方法]对云南省昭通市镇雄县场坝镇和泼机镇共16个村落277个王姓家系的542份样本,用mtDNAHVI引物扩增并对PCR扩增产物纯化后直接测序,统计样本序列的多态点信息,再应用MEGA X和DnaSP5等软件进行统计分析。对收集的毛干和指甲样本则分别使用改良后的QIA Investigator试剂盒法和改良后的MagAttract M48 DNA Manual Ki试剂盒法提取mtDNA模板,并用普通PCR和巢式PCR两种扩增方法对其进行HVI的扩增和测序,并统计分析其多态点信息。

[结果]1、542份血卡样本mtDNA HVR-I及附近序列扩增的片段长550bp,实际检出298个单倍型,169个多态点发生2174次突变,多态以转换为主,占总多态点的88.30%,其中C/T转换占73.39%,颠换占总多态的11.19%,以A/C变异为主。单个样本最多检测出多态位点达9个,最少检测出0个多态点（同rCRS序列一致）。

2、双向测序的470个王姓样本单倍型多样度为0.9875±0.002,核酸多样度为0.01051±0.00024。

3、镇雄王姓mtDNA的HVI与其他地区汉族个体相比,存在一定差异。

4、硅膜法和磁珠法提取的毛发DNA经普通PCR和巢式PCR扩增后的PCR产物,经琼脂糖电泳后显示,两种扩增都能有效获得扩增片段,QIA硅膜法提取的模板DNA经过普通扩增能够得到目标片段,M48磁珠法提取的模板DNA经过巢式扩增后也能扩增出目标片段。

5、毛干和指甲样本的mtDNA HVI序列进行了统计分析,涉及的24例样本,共检见8种单倍型,20个多态性位点,多态点中以碱基转换为主31个;5号和6号样本检见颠换的位点有2个,未检见缺失位点。

6、同一个体的头发和指甲测序结果相同,未检见异质性。

[结论]1.本研究获得的镇雄县2镇542份王姓男性mtDNA HVR-I群体遗传学数据,证实镇雄县王姓mtDNA HVR-I有丰富的多态位点;

2. 同姓男性个体具有相类似的Y染色体单倍型,检验同姓男性的mtDNA,为进一步个体识别提供新视角;

3. 采用直接扩增联合直接测序法,可有效检测mtDNA HVR-I的多态性,并可以利用较高的单倍型多样性为相关案件侦查提供线索或依据;

4.改良后的QIA硅膜法对于毛干DNA的提取和扩增比M48磁珠法更有优势;5.mtDNA HVR-I多态性较好,可应用于法医学实践中。

参考文献

[1]The impact of common PCR inhibitors on forensic MPS analysis[J].Maja Sidstedt,Carolyn R.Steffen,Kevin M.Kiesler,Peter M.Vallone,Peter R?dstr?m,Johannes Hedman.Forensic Science International:Genetics.2019

[2]DNA transfer in forensic science:A review[J].Roland A.H.van Oorschot,Bianca Szkuta,Georgina E.Meakin,Bas Kokshoorn,Mariya Goray.Forensic Science International:Genetics.2019

[3]Massively parallel sequencing techniques for forensics:A review[J].Brigitte Bruijns,Roald Tiggelaar,Han Gardeniers.ELECTROPHORESIS.2018(21)

[4]Isolation of Mitochondrial DNA from Single,Short Hairs without Roots Using Pressure Cycling Technology[J].Kathryn A.Harper,Kelly A.Meiklejohn,Richard T.Merritt,Jessica Walker,Constance L.Fisher,James M.Robertson.SLAS Technology.2018(1)

[5]李维丽.镇雄王姓mtDNA HVI多态性研究及法医学应用[D].昆明医科大学,2019.