大鼠谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中大鼠谷胱甘肽（GSH）的含量。

实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠谷胱甘肽（GSH）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠谷胱甘肽（GSH）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于槲皮素调节大鼠肝细胞谷胱甘肽代谢信号转导通路的研究

通过细胞实验探讨槲皮素对谷胱甘肽及与其代谢相关的四种重要的酶（谷胱甘肽过氧化物酶,GSH-Px、谷胱甘肽硫转移酶,GST、谷胱甘肽还原酶,GR和Y-谷氨酰基半胱氨酸连接酶,γ-GCL）的活性以及基因转录水平的的作用。并应用三种代表性MAPKs激酶的抑制剂（SP600125、SB203580、PD98059）探讨槲皮素对MAPKs和Keapl-Nrf2-ARE通路的影响机制及作用靶点,为认识槲皮素调节GSH代谢的作用及其相关机制和进一步研究槲皮素发挥抗氧化能力防御自由基对人体的健康损害作用机制提供科学依据。

方法1.用5、10和20、30、40和50μmol/L槲皮素干预大鼠肝细胞24h后,采用MTT法检测细胞活力。用5、10和20μmol/L槲皮素干预大鼠肝细胞24h后,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率,试剂盒检测细胞培养液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性,高效液相色谱法检测大鼠肝细胞中还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量,以及试剂盒检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、谷胱甘肽还原酶（GR）和γ-谷氨酰基半胱氨酸连接酶（γ-GCL）活性。

2. 使用不同浓度的三种MAPKs抑制剂干预大鼠肝细胞,使用MTT法检测细胞活力变化。

3. 将大鼠肝细胞分为Control组、Q组（槲皮素干预组）、SP组（SP600125干预组）、SB组（SB203580干预组）、PD组（PD98059干预组）、Q+SP组（槲皮素和SP600125干预组共同干预组）、Q+SB组（槲皮素和SB203580干预组共同干预组）、Q+PD组（槲皮素和PD98059干预组共同干预组）,使用RT-PCR检测各组GSH-Px、GST、GR和γ-GCL基因转录水平变化,使用Western blot法检测P38,p-P38蛋白水平变化,使用Luminex法检测JNK、p-JNK、ERK和p-E RK蛋白水平变化,。使用ELLESA试剂盒检测Keapl蛋白水平变化。

结果1.30μmol/L以上剂量的槲皮素干预组细胞活性显著降低。20μmol/L槲皮素干预大鼠肝细胞24h后细胞GSH含量、GST和γ-GCL活性显著升高,GSH-Px活性显著降低。

2.10-100μmol/L浓度的SP600125,30μmol/L-100μmol/L浓度的SB203580,50μmol/L-100μmol/L浓度的PD98059对大鼠肝细胞活力产生抑制作用。

3.Q组与对照组相比,GSH-Px、GST、GR三种酶基因的转录水平显著提高,JNK、ERK和p-ERK水平降低、p-JNK和Keapl水平升高。

4. SP组与对照组相比,γ-GCL转录水平和JNK水平降低,p-JNK水平升高。Q+SP组较SP组JNK水平降低,γ-GCL转录水平,P-JNK和Keapl水平升高。

5.PD组与对照组相比,ERK、p-ERK水平降低,GSH-Px、γ-GCL的mRNA和Keap1水平升高。Q+PD组较PD组GSH-Px、GST、GR、γ-GCL转录水平、ERK和p-ERK蛋白水平降低,Keapl水平升高。结论槲皮素能够促进MAPKs通路JNK的磷酸化和提高KEAP1水平促进γ-GCL基因的表达从而促进谷胱甘肽的合成,并提高GSTmRNA水平。

参考文献

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[2]Impaired synthesis and antioxidant defense of glutathione in the cerebellum of autistic subjects:Alterations in the activities and protein expression of glutathione-related enzymes[J].Feng Gu,Ved Chauhan,Abha Chauhan.Free Radical Biology and Medicine.2013

[3]Attenuation of berberine on lipopolysaccharide-induced inflammatory and apoptosis responses in＆beta;-cells via TLR4-independent JNK/NF-＆kappa;B pathway[J].Ying Wang.Pharmaceutical Biology.2013(4)

[4]Inhibitory effects of berberine on lipopolysaccharide-induced inducible nitric oxide synthase and the high-mobility group box 1 release in macrophages[J].Danbi Lee,Jinbum Bae,Yoon Kyu Kim,Minchan Gil,Joo-Yong Lee,Chan-Sik Park,Kyung Jin Lee.Biochemical and Biophysical Research Communications.2013(3)

[5]冯建.槲皮素调节大鼠肝细胞谷胱甘肽代谢信号转导通路的研究[D].山东大学,2016.