人谷胱甘肽(GSH)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人谷胱甘肽(GSH)ELISA KIT用于血清、血浆、细胞培养上清液和生物体液内谷胱甘肽(GSH)的定量检测。

原理：实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人GSH单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的GSH与单抗结合，加入生物素化的抗人GSH，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，GSH浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中GSH浓度。

人谷胱甘肽(GSH)ELISA KIT

准备试剂与收集血样

1.收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。血清、血浆作1：1 00稀释（取1 0ul，加标本稀释液99 0ul,稀释10 0倍），尿液2倍稀释(取10 0ul，加标本稀释液10 0ul,稀释2倍)后检测。细胞培养上清可以不做稀释直接检测。

2.标准品液配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成4000pmol/ml的溶液。设标准管8管，每管加入标本稀释液20 0ul。在管中加入4000pmol/ml的标准品溶液2 00ul混匀后用加样器吸出2 00ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出2 00ul弃去。第八管为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:1 0倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔中加入抗体工作液10 0ul。将反应板充分混匀后置37℃6 0分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃3 0分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在45 0 nm处测吸光值。

应用^[4][5]

用于外源谷胱甘肽通过γ-谷氨酰循环促进牛早期胚胎内GSH的合成研究

旨在揭示外源GSH促进胚胎内GSH合成和促进胚胎发育的机制,为提高体外胚胎的生产效率提供切实的理论基础。

牛体外受精胚胎分别于3 mM GSH、GSX和不含GSH（对照组）的培养液中培养7d,统计两组的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数;采用荧光染色法和LC/MS法检测不同发育阶段受精卵中ROS和GSH含量;在培养液中添加GSX,利用LC/MS对受精卵内GSX含量变化进行跟踪检测。结果表明,外源添加GSH可显著降低胚胎内ROS含量（P<0.05）,提高囊胚率和囊胚总细胞数（P<0.05）。荧光染色法和LC/MS法均检测到各发育阶段的处理组受精卵中GSH的含量显著高于对照组（P<0.05）,且两组受精卵中GSH含量均随发育进程而呈现下降趋势。外源添加GSX后,处理组受精卵中GSH的含量显著升高（P<0.05）,而GSX含量较低,仅为GSH含量的1/5;且培养液中GSX的含量随培养时间的延长而持续下降。可见,外源GSH可清除胚胎中部分ROS,提高胚胎发育率和囊胚质量;LC/MS是定量分析GSH及其同位素标记物的可靠方法,可用于外源GSH影响胞内GSH合成和促进胚胎发育的机制研究。

牛体外受精卵分别于3 mM GSH（处理组）或不含GSH（对照组）的培养液中培养32 h,比较两组胚胎间GSH合成相关酶的基因表达水平及酶活性。添加GSH后,GSS、GGT和GCLM基因表达水平显著升高,GGT活性显著升高（P<0.05）。5-OPase和GCLC基因在精卵共孵育24 h的处理组受精卵中表达量均显著低于对照组,其他时间段的处理组和对照组胚胎中没有显著差异（P>0.05）。添加GSH可提高胚胎内γ-谷氨酰循环途径中GSH合成相关酶的基因表达水平和GGT酶活性。

GSH合成相关关键酶GCL和GGT的抑制剂BSO和Acivicin活性分别处理对照组和GSX组的胚胎,统计胚胎发育率,并检测不同发育阶段受精卵中的GSX和GSH含量。结果两种抑制剂均显著降低胚胎的卵裂率和囊胚率,抑制剂Acivicin处理后,早期胚胎甚至不能发育至囊胚阶段。另外,受精卵中GSX和GSH含量均显著下降,表明抑制GCL酶和GGT酶的活性会阻碍外源GSH对胞内GSH合成的促进作用。因此,外源GSH通过γ-谷氨酰循环诱导胚胎中GSH的重新合成。本文在牛胚胎培养液中添加GSH同位素标记物GSX(GSH-(Glycine-13C215N)),利用LC/MS对胚胎中GSH及GSX水平进行定量和追踪检测;对GSH合成相关酶的基因的表达水平进行分析并检测受精卵中GGT酶活性,以及对关键酶的抑制多方面探究外源GSH对促进胚胎发育的作用途径。

参考文献

[1]Viscum articulatum Burm.f.aqueous extract exerts antiproliferative effect and induces cell cycle arrest and apoptosis in leukemia cells[J].Ruchi Mishra,Saurabh Sharma,Radhey Shyam Sharma,Savita Singh,Milind Madhav Sardesai,Sadhna Sharma,Vandana Mishra.Journal of Ethnopharmacology.2018

[2]Biomarkers of tumour redox status in response to modulations of glutathione and thioredoxin antioxidant pathways[J].Julie Kengen,Jean-Philippe Deglasse,Marie-Aline Neveu,Lionel Mignion,Céline Desmet,Florian Gourgue,Jean-Christophe Jonas,Bernard Gallez,Bénédicte F.Jordan.Free Radical Research.2018(2)

[3]A novel in vitro experimental system for the evaluation of drug metabolism:Cofactor-supplemented permeabilized cryopreserved human hepatocytes（MetMax?Cryopreserved Human Hepatocytes）.[J].Li Albert P,Ho Ming-Chih David,Amaral Kirsten,Loretz Carol.Drug metabolism and disposition:the biological fate of chemicals.2018(11)

[4]Functional characterisation of glutathione export from the rat lens[J].Ankita Umapathy,Bo Li,Paul J.Donaldson,Julie C.Lim.Experimental Eye Research.2018

[5]李凤.外源谷胱甘肽通过γ-谷氨酰循环促进牛早期胚胎内GSH的合成[D].中国农业科学院,2018.