人胶质母细胞瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人胶质母细胞瘤细胞是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤。肿瘤位于皮质下，多数生长于幕上大脑半球各处。呈浸润性生长，常侵犯几个脑叶，并侵犯深部结构，还可经胼胝体波及对侧大脑半球。发生部位以额叶最多见。

原发性胶质母细胞瘤与继发性胶质母细胞瘤的分子发生机制不同。原发性胶质母细胞瘤的分子改变以表皮生长因子受体（EGFR）的扩增与过量表达为主，而继发性胶质母细胞瘤则以p53的突变为主。

人胶质母细胞瘤细胞

胶质母细胞瘤生长速度快，70%～80%患者病程在3～6个月，病程超过1年者仅10%。病程较长者可能由恶性程度低的星形细胞瘤演变而来。由于肿瘤生长迅速，脑水肿广泛，颅内压增高症状明显，所有患者都有头痛、呕吐症状。视盘水肿有头痛、精神改变、肢体无力、呕吐、意识障碍与言语障碍。肿瘤浸润性破坏脑组织，造成一系列的局灶症状，患者有不同程度的偏瘫、偏身感觉障碍、失语和偏盲等。神经系统检查可发现偏瘫、脑神经损害、偏身感觉障碍与偏盲。癫痫的发生率较星形细胞瘤和少枝胶质细胞瘤少见，部分患者有癫痫发作。部分患者表现为淡漠、痴呆、智力减退等精神症状。

应用^[4][5]

用于Smad6对人胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响及其调控机制研究

研究Smad6是否调控人胶质母细胞瘤细胞的增殖能力并明确相关的分子信号机制。

方法:（1）通过Western blot检测本院临床研究中心提供的原代人胶质母细胞瘤细胞中细胞核Smad6的表达水平;（2）构建慢病毒介导的Smad6细胞核稳定过表达胶质母细胞瘤细胞株和Smad6稳定敲减胶质母细胞瘤细胞株;（3）通过CCK-8细胞增殖实验检测Smad6对胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响;（4）通过裸鼠皮下荷瘤模型检测Smad6对胶质母细胞瘤细胞体内成瘤能力的影响;（5）通过STAT3报告基因质粒（SIE）的荧光素酶报告基因实验检测Smad6是否影响IL-6诱导的STAT3激活,并通过Western blot检测Smad6是否调控胶质母细胞瘤细胞中与增殖相关的STAT3靶基因表达。

结果:（1）选取四株原代胶质母细胞瘤细胞,分别编号为GBM-1、GBM-2、GBM-3和GBM-4,Western blot检测显示Smad6的表达水平在所选取的各株细胞的细胞核中各不相同。

（2）通过CCK-8细胞增殖实验检测,取接种4小时后各株细胞的吸光度值为1,显示这四株细胞的24、48和72小时增殖倍率如下:GBM-1为1.20±0.03、1.68±0.09、2.29±0.15;GBM-2为1.27±0.05、1.85±0.09、2.76±0.18;GBM-3为1.43±0.05、2.20±0.15、4.10±0.27;GBM-4为1.32±0.06、2.02±0.10、3.39±0.26。对这4株细胞的增殖能力进行两两比较,差异均具有统计学意义（P<0.05~0.001）。

（3）使用皮尔逊相关性分析计算所选取的四株细胞中细胞核Smad6的表达水平与细胞增殖能力之间的相关性（r=0.968,P﹤0.05）。

（4）通过荧光显微镜直接观察,在Smad6细胞核稳定过表达胶质母细胞瘤细胞株（Smad6-NLS）和它的阴性对照（Vector）、Smad6稳定敲减胶质母细胞瘤细胞株（Smad6-KD）和它的阴性对照（NC）中,均有绿色荧光蛋白表达。且Samd6-NLS和Vector的绿色荧光均聚集在细胞核中。

（5）Western blot实验结果显示,与Vector相比,Smad6表达水平在Smad6-NLS组中显著增高;与NC相比,Smad6表达水平在Smad6-KD组中显著降低。

（6）通过CCK-8细胞增殖实验检测这四株稳转细胞的24、48和72小时增殖倍率,取接种4小时后各组细胞的吸光度值为1,各组细胞的增殖倍率如下:Smad6-NLS为1.57±0.03、2.61±0.23、4.35±0.27;Vector为1.30±0.05、1.73±0.06、2.52±0.16;Smad6-KD为1.18±0.04、1.57±0.05、2.24±0.11;NC为1.41±0.04、2.07±0.14、3.88±0.25。Smad6-NLS和Vector、Smad6-KD和NC在72小时处的增殖倍率差异均具有统计学意义（P<0.001）。

参考文献

[1]STAT 3 the oncogene–still eluding therapy?[J].Matthew S.Wake,Christine J.Watson.FEBS Journal.2015(14)

[2]Slit/Robo pathway:a promising therapeutic target for cancer[J].Rishi K.Gara,Sonam Kumari,Aditya Ganju,Murali M.Yallapu,Meena Jaggi,Subhash C.Chauhan.Drug Discovery Today.2015(1)

[3]Smad6 Suppresses the Growth and Self‐Renewal of Hepatic Progenitor Cells[J].Ze‐Yang Ding,Hui‐Fang Liang,Guan‐Nan Jin,Wei‐Xun Chen,Wei Wang,Pran K.Datta,Ming‐Zhi Zhang,Bixiang Zhang,Xiao‐Ping Chen.J.Cell.Physiol..2014(5)

[4]Phosphorylation of EZH2 Activates STAT3 Signaling via STAT3 Methylation and Promotes Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells[J].Eunhee Kim,Misuk Kim,Dong-Hun Woo,Yongjae Shin,Jihye Shin,Nakho Chang,Young Taek Oh,Hong Kim,Jingeun Rheey,Ichiro Nakano,Cheolju Lee,Kyeung Min Joo,Jeremy N.Rich,Do-Hyun Nam,Jeongwu Lee.Cancer Cell.2013(6)

[5]张锐.Smad6对人胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响及其调控机制[D].南京医科大学,2018.