细菌素的挖掘、异源表达、纯化、抗菌机理及应用研究进展

细菌素是革兰氏细菌合成的一种低分子量核糖体多肽或蛋白质，可以抑制甚至杀死其他种类的微生物。该文章综述了细菌素的发掘方法，包括在不同表达系统的异源表达、细菌素的纯化技术和鉴定方法，以及细菌素在三种不同食品体系中的抗菌机理和应用。

一、简介

细菌素是革兰氏细菌合成的一种低分子量核糖体多肽或蛋白质，可以抑制甚至杀死起他种类的微生物。随着技术的发展，生物信息学的应用加快了细菌素的发现进程，常用的工具方法：BAGAL，antiSMASH，BACTIBASE，Proteomic and peptidome。目前细菌素主要来源从原细胞中提取，由于提取过程繁琐，细菌素的产率往往较低。为了提高具有生物活性的细菌素的产量，一些研究采用了外源表达策略。而细菌素的纯化和鉴定是获得纯细菌素的关键步骤。分离的细菌素主要通过电泳和质谱进行鉴定。微生物对细菌素的敏感性与细菌胞膜和细胞内生命活动的相互作用有关。细菌素的作用机制为攻击目标细菌基因，影响蛋白质复制、细胞渗透和孔隙形成。根据细菌素的抗菌活性，提出了细菌素在食品工业中的应用策略。

二、细菌素的分类

根据分子量、化学结构、热稳定性、表达修饰等特性，细菌素大致分为四类，具体分类及特征如表1。

表1 细菌素的分类

三、异源表达

细菌素在野生菌株中一般产量很低，为了提高产量，许多研究人员对生产异源表达细菌素的重组蛋白进行研究。细菌素的生产一般有四种异源表达策略：大肠杆菌，乳杆菌，酵母细胞和化学合成。

3.1  大肠杆菌

大肠杆菌具有明确的遗传背景，用大肠杆菌系统进行异源表达细菌素便于控制、培养成本低、外源蛋白表达量高。

一些细菌素在大肠杆菌表达系统中成功表达，如尼生素，羊毛硫细菌素 HJ50，片球菌素PA-1等。细菌素的表达和活性受大肠杆菌菌株和培养温度等多种因素的影响（表2）。

表2 细菌素在大肠杆菌细胞中的异体表达

3.2  乳杆菌

乳酸杆菌用于细菌素表达的质粒，宿主和培养条件总结于表3。

表3 乳酸乳球菌细胞中细菌素的异种表达

3.3酵母细胞

外源表达的细菌素一半产量较低，有些甚至活力低或没有抗菌活性。在建立良好的酵母表达平台重组表达的蛋白仍活性低甚至无活性（表4）。

表4 酵母细胞中细菌素的异源表达

3.4化学合成

据报道，采用标准固相肽合成(SPPS)，在HMPB-ChemMatrix树脂中使用Fmoc/tBu策略合成Pediocin PA-1。合成的pediocin PA-1对单核细胞生成素具有抗菌活性。

化学合成是微生物发酵后不经过复杂纯化而获得纯细菌素的一种较好的方法。然而，未来的研究应该转向增加产量和降低生产成本。

四、细菌素的纯化和鉴定

细菌素的纯化是进一步研究细菌素性质和活性的关键步骤，涉及多个步骤，耗时较长。据报道，沉淀、离子交换色谱和反相色谱是主要的方法。

有一些方法可以鉴定分离出的细菌素的近似摩尔质量，如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)可以准确分析分离出的细菌素的分子量。为了进一步鉴定细菌素，可以通过MALDI-TOF-MS/MS检测氨基酸的组成和序列。

五、抗菌机制

细菌素的杀菌机理与细菌素的种类和指示菌密切相关，与抗生素不同。这些机制可分为细胞包膜和抑制基因表达。

5.1   细胞壁和膜的完整性

细胞壁和细胞膜的完整性对正常细胞是至关重要的。一些I类细菌素(如nisin)可以抑制肽聚糖合成并形成气孔;II类细菌素(如乳球菌素A)可与甘露糖磷酸转移酶系统(Man-PTS)结合形成气孔（图1a）。许多细菌素通过干扰基因表达来控制目标细菌（图1b）。

图1 细菌素的抗菌机制。

5.2   基因表达抑制

一些细菌素可通过跨膜作用进入细胞，干扰细胞的正常生命活动。细菌素MccB17借助孔蛋白OmpF穿过外膜，通过转运蛋白SbmA穿过内膜，调控DNA旋回酶和超螺旋，从而干扰DNA复制。同样，细菌素MccC7-C51在OmpF的帮助下穿过外膜。不同的是，MccC7C51在YejABEF 转运蛋白133的帮助下穿过大肠杆菌的细胞膜，然后被细菌的许多广谱特异性细胞质氨肽酶修饰，形成修饰的天冬氨酸腺苷。相反，天冬氨酸-tRNA合成酶被抑制，mRNA合成被阻断，从而达到抑制作用。

来源：十六号酶库