ROS1728 大鼠成骨细胞的应用

背景^[1-3]

ROS1728大鼠成骨细胞分离自颅骨组织；颅骨位于脊柱上方，由23块形状和大小不同的扁骨和不规则骨组成。

除下颌骨及舌骨外，其余各骨彼此借缝或软骨牢固连结，起着保护和支持脑、感觉器官以及消化器和呼吸器的起始部分的作用。颅分脑颅和面颅两部分。脑颅位于颅的后上部，内有颅腔，容纳脑，共8块。面颅为颅的前下部分，包含眶、鼻腔、口腔等结构，构成面部的支架，共15块。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨；破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。

ROS1728大鼠成骨细胞

成骨细胞培养不仅有助于了解骨形成机制、骨骼系统疾病的分子和细胞学基础，也是药物筛选、生物材料开发和生物工程研究的重要手段。

培养条件：

完全培养基：DMEM，90%；胎牛血清10%。

培养条件：37.0C carbon dioxide（CO2）,5%

传代方法：

收到细胞后，取出培养瓶在倒置显微镜下观察细胞生长情况。

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，仅留下10ml培养液在瓶内继续培养。

（二）如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1.弃去培养液，用PBS（不含钙，镁离子）洗1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒转放于37度培养箱1-3分钟预热，然后又将培养瓶倒转大约30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆分散，轻敲几下培养培养瓶，细胞随即脱落下来。

3.加入6-8ml完全培养基，吸出，分到新的培养瓶中。

应用^[4][5]

用于人甲状旁腺激素对糖尿病大鼠骨质疏松的影响及其分子机制的研究

研究旨在明确PTH是否能够通过mTOR/PI3K信号通路发挥改善骨质疏松的作用,同时探讨糖尿病对上述作用的影响。

方法（1）将92只雄性SD大鼠随机分为2组,其中48只注射STZ建立糖尿病模型,另44只注射相应生理盐水,连续注射4周后,检测大鼠血糖浓度。对大鼠行脊柱融合手术,将大鼠分成糖尿病组与非糖尿病组,每组又分为control和hPTR组,分别注射生理盐水和hPTH。检测上述各组大鼠血清中BMP-2水平。待大鼠处死后采集脊柱样本,检测骨组织中BMPR2蛋白、p-mTOR和p-PI3K蛋白的表达。分别将hPTH、hPTH+Rapamycin/hPTH+LY294002作用于脊柱融合后的糖尿病大鼠或非糖尿病大鼠,检测大鼠血清中BMP-2水平和脊柱中BMPR2蛋白表达。

（2）将ROS1728细胞随机分为非高糖组和高糖组,每组又分为control组和hPTH组,向hPTH组细胞中加入hPTH。检测各组细胞的增殖活性和凋亡情况。检测各组细胞中BMP-2和BMPR2 mRNA的表达,检测细胞中BMP-2、BMPR2、p-mTOR和p-PI3K蛋白的表达。分别将hPTH、hPTH+Rapamycin/hPTH+LY294002作用于非高糖或高糖环境下的ROS1728细胞,检测上述各组细胞中BMP-2和BMPR2蛋白的表达。

结果（1）结果显示,在注射生理盐水的大鼠中,hPTH给药后大鼠血清BMP-2水平和骨组织中BMPR2、p-mTOR和p-PI3K蛋白的表达水平均显著增高（P<0.05）;而在注射STZ的大鼠中,hPTH给药后大鼠血清BMP-2水平和骨组织中BMPR2、p-mTOR和p-PI3K蛋白的表达水平则较control组无显著差异。在注射生理盐水的大鼠中,hPTH给药后大鼠血清中BMP-2水平和骨组织中BMPR2蛋白的表达量均显著高于control组（P<0.05）;而当将雷帕霉素或LY294002作用于大鼠后,上述对BMP-2和BMPR2蛋白表达的促进作用则被抑制,大鼠血清中BMP-2水平和骨组织中BMPR2蛋白的表达水平均与control组相比无显著差异。在注射STZ的大鼠中,hPTH给药后大鼠血清中BMP-2水平和骨组织中BMPR2蛋白的表达量均与control组相比无显著差异;当将雷帕霉素或LY294002作用于大鼠后,大鼠血清中BMP-2水平和骨组织中BMPR2蛋白的表达量与control组相比仍无显著差异。

（3）在非高糖环境下的ROS1728细胞中,hPTH给药后细胞的增殖活性较control组显著增高（P<0.05）,凋亡率显著降低（P<0.05）;而在高糖环境下,hPTH给药后ROS1728细胞的增殖活性、凋亡率则与control组无显著差异。在非高糖环境下的ROS1728细胞中,hPTH给药后细胞中BMP-2和BMPR-2 mRNA和蛋白的表达水平、p-mTOR和p-PI3K蛋白的表达水平均较control组明显增高（P<0.05）;而在高糖环境下,hPTH给药后ROS1728细胞中BMP-2和BMPR-2 mRNA和蛋白的表达水平、p-mTOR和p-PI3K蛋白的表达水平则与control组无显著差异。

在非高糖环境下,hPTH给药后ROS1728细胞中BMP-2和BMPR2蛋白的表达水平均较control组明显增高（P<0.05）;而当将mTOR抑制剂雷帕霉素作用于细胞后,hPTH对BMP-2和BMPR2蛋白表达的促进作用则被抑制,细胞中BMP-2和BMPR2蛋白的表达水平均与control组相比无显著差异;当将PI3K抑制剂LY294002作用于细胞后,hPTH对BMP-2和BMPR2蛋白的表达无影响,细胞中BMP-2和BMPR2蛋白的表达水平均与control组相比无显著差异。在高糖环境下,hPTH给药后ROS1728细胞中BMP-2和BMPR2蛋白的表达水平与control组相比无显著差异;当将雷帕霉素作用于大鼠后,细胞中BMP-2和BMPR2蛋白的表达水平与control组相比仍无明显差异;当将LY294002作用于细胞后,hPTH对BMP-2和BMPR2蛋白的表达无影响,细胞中BMP-2和BMPR2蛋白的表达水平均与control组相比无显著差异。

参考文献

[1]Implementing a Multidisciplinary Clinical Pathway Can Reduce the Deep Surgical Site Infection Rate After Posterior Spinal Fusion in High-Risk Patients[J].Michael Glotzbecker,Michael Troy,Patricia Miller,Jay Berry,Lara Cohen,Alexandra Gryzwna,Mary Ellen McCann,M.Timothy Hresko,Susan Goobie,John Emans,Robert Brustowitz,Brian Snyder,Daniel Hedequist.Spine Deformity.2019(1)

[2]The Impact of Type 2 Diabetes on Bone Metabolism and Growth after Spinal Fusion[J].Neil Bhamb,Linda E.A.Kanim,Ruben C.Maldonado,Trevor J.Nelson,Khosrowdad Salehi,Juliane D Glaeser,Melodie F.Metzger.The Spine Journal.2018

[3]Comparative Effect of rhPTH（1‐84）on Bone Mineral Density and Trabecular Bone Score in Hypoparathyroidism and Postmenopausal Osteoporosis[J].Cristiana Cipriani,Jessica Pepe,Barbara C Silva,Mishaela R Rubin,Natalie E Cusano,Donald J McMahon,Luciano Nieddu,Maurizio Angelozzi,Federica Biamonte,Daniele Diacinti,Didier Hans,Salvatore Minisola,John P Bilezikian.Journal of Bone and Mineral Research.2018(12)

[4]Delivery of the improved BMP-2-Advanced plasmid DNA within a gene-activated scaffold accelerates mesenchymal stem cell osteogenesis and critical size defect repair[J].Rosanne M.Raftery,Irene Mencía-Casta?o,Simon Sperger,Gang Chen,Brenton Cavanagh,Georg A.Feichtinger,Heinz Redl,Ara Hacobian,Fergal J.O’Brien.Journal of Controlled Release.2018

[5]武士清.人甲状旁腺激素对糖尿病大鼠骨质疏松的影响及其分子机制的研究[D].山东大学,2020.