人肝癌细胞HUH-7的应用

背景^[1-3]

人肝癌细胞HUH-7是由Naka-bayashi等人建立的，细胞源自一个日本男性高分化肝细胞肝癌，HBV阴性，能产生一些细胞质蛋白，如白蛋白、a抗胰蛋白酶、AFP等。

肝癌(liver cancer)是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们日常说的肝癌指的多是原发性肝癌。原发性肝癌（primary carcinoma of liver)是指发生在肝细胞或肝内胆管细胞的癌肿，该疾病是目前我国第四位的常见恶性肿瘤及第三位的肿瘤致死病因，严重威胁我国人民的生命和健康。原发性肝癌主要包括肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）、肝内胆管（Intrahepatic Cholangiocarcinoma，ICC）和HCC-ICC混合型三种不同病理类型，三者在发病机制、生物学行为、组织学形态、治疗方法以及预后等方面差异较大，其中肝细胞癌占到85%-90%以上，因此本章中的“肝癌”指肝细胞癌。本病恶性程度高，浸润和转移性强，远期疗效取决于能否早期诊断及早期治疗，甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP)和影像学检查相结合是早期诊断的主要辅助手段。

人肝癌细胞HUH-7

人肝癌细胞(HuH-7)培养步骤

一．人肝癌细胞(HuH-7)培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基(DMEM，GIBCO，货号11965-092)，添加1%NEAA，优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

用于绞股蓝含药血浆对人肝癌Huh-7细胞的增殖、迁移及TGF-β1的影响研究

观察绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum GP）含药血浆对人肝癌Huh-7细胞增殖、迁移及对转化生长因子β1（TGF-β1）的影响,初步探讨绞股蓝影响肝癌细胞增殖、迁移的作用机制。

方法:根据血浆药理学研究原理,选健康成年SD大鼠,采用绞股蓝水煎剂灌胃,以及生理盐水灌胃的正常空白血浆对照组,用EDTA抗凝管收集绞股蓝含药血浆。对人类肝癌细胞株Huh-7进行体外培养,进行细胞实验。实验组予10%绞股蓝含药血浆培养液与肝癌Huh-7细胞共同培养,对照组予10%浓度的空白血浆与肝癌Huh-7细胞共同培养,并设立生理盐水空白对照组。

通过CCK8比色法实验对不同浓度的空白血浆进行检测,得出实验浓度,然后以该浓度进行后续实验。通过细胞划痕实验测量并计算0h、24h、48h后的对照组和实验组细胞的迁移速率、迁移抑制率,观察绞股蓝对肝癌细胞Huh-7迁移的抑制作用。用CCK8比色法实验分别对培养24h、48h后的空白血浆组、空白对照组和绞股蓝含药血浆组细胞进行检测,计算其吸光度OD值以及细胞增殖的抑制率,观察绞股蓝对肝癌Huh-7细胞的增殖抑制作用。

用细胞免疫荧光法检绞股蓝含药血浆对肝癌Huh-7细胞中TGF-β1表达的影响。采用qRT-PCR的方法检测绞股蓝含药血浆在肝癌Huh-7细胞中TGF-β1mRNA的表达,采用Western blot法检测绞其在绞股蓝含药血浆在肝癌Huh-7细胞中的TGF-β1蛋白表达情况。

结果:1.CCK-8结果显示,1%,5%,10%,15%含药血浆对人肝癌Huh-7细胞的抑制率分别为-14.13%、-32.08%、16.70%和38.2%。当浓度为1%和5%,时是促进肿瘤细胞的增殖,当浓度为10%时血浆对肝癌细胞的抑制作用最弱,且浓度适中,又保证含药血浆的药物浓度。实验中绞股蓝血浆组较对照组明显抑制肝癌Huh-7细胞的体外增殖的作用。其中第24h,48h的平均抑制率为0.2%（P<0.05）、0.36（P<0.05）。2.划痕实验结果显示,不同处理的肝癌Huh-7细胞,在给药后0h、24h、48h,,含药血浆组的划痕距离较空白血浆及空白对照组增加,空白血浆与空白对照组无差异（P>0.05）,且48h的迁移速度与24小时的迁移速率降低（P<0.05）。

3.荧光免疫结果显示,绞股蓝含药血浆使肝癌Huh-7细胞中的TGF-β1呈现低表达状态,而空白血浆对照组以及无添加一抗组则中的TGF-β1则呈现低表达状态。

4. RT-PCR结果显示,绞股蓝含药血浆对肝癌细胞中TGF-β1的基因表达量呈下降趋势,与空白血清对照相比,差异具有显著性（P<0.01）。

5. Western Blot结果显示,绞股蓝含药血浆可使TGF-β1的蛋白含量降低,与空白血清对照,有显著性差异（P<0.01）。

结论:绞股蓝含药血浆对肝癌Huh-7细胞的增殖、侵袭迁移均具有明显的抑制作用。且的浓度是10%,48h的抑制作用强于24h。其机理可能与下调TGF-β1表达有关。

参考文献

[1]Gypensapogenin H,a novel dammarane-type triterpene induces cell cycle arrest and apoptosis on prostate cancer cells[J].Xiao-Shu Zhang,Chen Zhao,Wei-zhuo Tang,Xiao-jun Wu,Yu-Qing Zhao.Steroids.2015

[2]Protease profiling of liver fibrosis reveals the ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif,1 as a central activator of transforming growth factor beta[J].Katia Bourd‐Boittin,Dominique Bonnier,Anthony Leyme,Bernard Mari,Pierre Tuffery,Michel Samson,Frédéric Ezan,Georges Baffet,Nathalie Theret.Hepatology.2011(6)

[3]Dammarane-type saponins from Gynostemma pentaphyllum[J].Ji Ho Kim,Yong Nam Han.Phytochemistry.2011(11)

[4]Gypenosides Induce Apoptosis in Human Hepatoma Huh-7 Cells through a Calcium/Reactive Oxygen Species-Dependent Mitochondrial Pathway[J].Qwa-Fun Wang,Chi-Wu Chiang,Chun-Chi Wu,Chi-Chih Cheng,Shur-Jong Hsieh,Jung-Chou Chen,Yun-Chih Hsieh,Shih-Lan Hsu.Planta Med.2007(06)

[5]莫晓丽.绞股蓝含药血浆对人肝癌Huh-7细胞的增殖、迁移及TGF-β_1的影响[D].广西中医药大学,2017.