THP-1细胞的应用

背景^[1-3]

THP-1细胞是1980年Tsuchiya等人建立的人单核细胞白血病细胞系。它来自一位急性单核细胞白血病患者的血液，有分化为多种巨噬细胞的能力，是各领域研究常用的细胞系之一。

THP-1细胞

细胞常规培养步骤（请严格遵守无菌操作）

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基

混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将

所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约6ml培养基，培

养过夜），第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

细胞名称THP-1人单核细胞白血病

生长特性悬浮形态特性淋巴母细胞样

培养条件RPMI-1640+10%FBS+1%双抗

生长条件气相：5%CO2；95%空气温度：37℃

传代方法1:2传代，2~3天换液/传代

冻存条件90%FBS+10%DMSO支原体检测阴性

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养瓶中上清液，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2

分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻

敲几下培养瓶后加6ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。

3.吹打匀后吸出，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：4的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于类风湿关节炎患者外周血维生素D水平及活性维生素D调控lncRNA HOTAIR影响THP-1细胞功能的研究

探讨RA患者内源性VitD水平及其与血清细胞因子、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞及疾病活动度的相关性,在此基础上,进一步明确补充外源性1,25（OH）2D3影响THP-1细胞功能的机制,并阐明HOTAIR在其中的作用。

方法:1.选取确诊的初发RA患者及年龄性别匹配的健康对照各54例,采用ELISA检测25（OH）D3水平,改良流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测淋巴细胞亚群绝对数量,流式细胞术微球芯片捕获技术（cytometric bead array,CBA）检测血清细胞因子水平,DAS28（ESR）评估疾病活动度。

2. 通过体外慢病毒载体介导的HOTAIR过表达及基因沉默干扰HOTAIR对THP-1细胞进行感染,构建体外细胞培养体系,并将其分为HOTAIR表达增强组、过表达阴性对照组、HOTAIR表达抑制组、干扰阴性对照组、空白对照组。通过Deltavision Ultra观察细胞状态及活性,FCM测定感染效率,嘌呤霉素盐酸盐筛选稳定感染的细胞株,并扩大培养成功感染的细胞株。各组分别加入不同浓度（10,30,100）n M/m L的1,25（OH）2D3,对照组给予等量乙醇,37℃,5%CO2培养4,24及48小时后分别收集细胞。通过Real-time PCR检测HOTAIR、VDR、IL-1β及NF-κB在转录水平的表达,分析1,25（OH）2D3对THP-1细胞功能的影响。

结果:1.与健康对照组相比,RA患者25（OH）D3水平显著降低（p<0.001）,Th1细胞、Th17细胞的百分比与绝对值均明显升高（p<0.05）,Th2细胞、Treg细胞的百分比与绝对值均明显降低（p<0.01）。此外,RA患者IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α及IFN-γ水平均明显高于健康对照组（p<0.001）。同时,25（OH）D3水平与DAS28、ESR、CRP、Ig M、IL-6、IL-17呈明显负相关（p<0.05）,与CD4+Th细胞、Treg细胞呈明显正相关（p<0.05）。

3. 感染48h后,Deltavision Ultra观察到HOTAIR表达增强组、过表达阴性对照组、HOTAIR表达抑制组、干扰阴性对照组细胞状态良好,均有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）表达。嘌呤霉素盐酸盐筛选后,FCM检测结果显示各组细胞GFP表达效率大于90%。HOTAIR表达增强组THP-1细胞表达HOTAIR mRNA水平显著高于对照组、空白组及干扰组,差异有统计学意义（p<0.05）,HOTAIR表达抑制组THP-1细胞表达HOTAIR mRNA水平显著低于对照组、空白组及过表达组,差异有统计学意义（p<0.05）。HOTAIR表达增强组、过表达对照组、HOTAIR表达抑制组、干扰对照组及空白组VDR、NF-κB mRNA水平无显著差异（p>0.05）。值得注意的是,HOTAIR表达增强组IL-1βmRNA水平显著高于空白组、HOTAIR表达抑制组及对照组,差异有统计学意义（p<0.05）。

空白组THP-1细胞表达HOTAIR、VDR和IL-1βmRNA水平受1,25（OH）2D3的调控,且与刺激浓度和作用时间相关;但NF-κB mRNA水平无显著差异（p>0.05）。此外,在HOTAIR表达增强组,1,25（OH）2D3可降低THP-1细胞表达HOTAIR、VDR和IL-1βmRNA水平（p<0.05）,但随着1,25（OH）2D3浓度的增加和作用时间的延长NF-κB的表达水平未发生显著改变（p>0.05）。在干扰HOTAIR后,1,25（OH）2D3亦可降低THP-1细胞表达HOTAIR和VDR mRNA水平（p<0.05）,但对IL-1β的调控作用减弱。结论:维生素D可能是RA发生发展的重要因素,且活性维生素D可通过HOTAIR调控THP-1细胞的功能并抑制细胞因子转录水平的表达。

参考文献

[1]The Gut Microbiota at the Service of Immunometabolism.[J].Michaudel Chloé,Sokol Harry.Cell metabolism.2020(4)

[2]Bile acid metabolites control TH17 and Treg cell differentiation.[J].Hang Saiyu,Paik Donggi,Yao Lina,Kim Eunha,Trinath Jamma,Lu Jingping,Ha Soyoung,Nelson Brandon N,Kelly Samantha P,Wu Lin,Zheng Ye,Longman Randy S,Rastinejad Fraydoon,Devlin A Sloan,Krout Michael R,Fischbach Michael A,Littman Dan R,Huh Jun R.Nature.2019(7785)

[3]CD28 Autonomous Signaling Up-Regulates C-Myc Expression and Promotes Glycolysis Enabling Inflammatory T Cell Responses in Multiple Sclerosis[J].Martina Kunkl,Manolo Sambucci,Serena Ruggieri,Carola Amormino,Carla Tortorella,Claudio Gasperini,Luca Battistini,Loretta Tuosto.Cells.2019(6)

[4]Functional reprogramming of regulatory T cells in the absence of Foxp3.[J].Charbonnier Louis-Marie,Cui Ye,Stephen-Victor Emmanuel,Harb Hani,Lopez David,Bleesing Jack J,Garcia-Lloret Maria I,Chen Karin,Ozen Ahmet,Carmeliet Peter,Li Ming O,Pellegrini Matteo,Chatila Talal A.Nature immunology.2019(9)

[5]秦艳.类风湿关节炎患者外周血维生素D水平及活性维生素D调控lncRNA HOTAIR影响THP-1细胞功能的研究[D].山西医科大学,2021.