小牛血清(无菌过滤)的应用

背景^[1-3]

小牛血清(无菌过滤)取自出生10－30天的小牛或出生三月龄小牛动脉采血分离的血清再经0.1um滤膜过滤的无菌血清。

血清微生物包括细菌、霉菌、支原体、噬菌体等。随着各个品牌血清生产条件的改善提高，细菌、霉菌等“大型”微生物几乎能100%控制。支原体通过0.1um3次无菌过滤去除。关于噬菌体主要是生产环境过程中带入，又无法过滤，很难彻底清除但对血清质量影响不大，可以采用γ照射的胎牛血清来避免噬菌体。

小牛血清(无菌过滤)

小牛血清的功能：

小牛血清是细胞培养中用量的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。

（1）提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。

（2）提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。

（3）有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

（4）是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。

（5）起酸碱度缓冲液作用。

（6）提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

解冻血清注意事项：避免产生沉淀物

（1）解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃，实验显示非常容易产生沉淀物。

（2）解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生

（3）请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。

（4）血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

（5）若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理。欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。但不建议以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

应用^[4][5]

用于毛囊定向重建实验研究

随着毛囊的周期性循环,毛乳头的形态也发生着周期性的改变。它在毛囊的生长发育形成及周期调控中起着重要的作用。因此建立毛乳头细胞体外培养模型,对于详尽地了解毛乳头细胞体外培养生长特点,以及如何诱导毛囊的发生,具有重要的意义。研究小鼠皮肤毛囊细胞的分离方法。

方法：（1）小鼠皮肤毛囊细胞的分离培养与鉴定方法取3～5d C57BL/6J近交系乳鼠5只,置无菌培养皿中,安尔碘消毒3遍,PBS充分冲洗,转移至另一无菌培养皿中,剪下背部全层皮肤,平铺于培养皿中,加入0.2%Dispase,充分浸没组织块,置37℃水浴消化2h,倒掉消化液,用镊子小心提起全层皮肤平铺于另一干燥的无菌培养皿中,真皮面朝上,把真皮从表皮上剥离,表皮行常规石蜡切片HE染色。

PBS冲洗真皮,用剪刀修剪成小块,取一小块行常规石蜡切片H&E染色,其余置离心管中,在37℃缓慢搅拌的条件下加入0.2%Ⅰ型胶原酶消化30分钟,加入适量完全培养基稀释消化液,充分振荡,经250μm筛网（60 TYLER MESH）过滤后收集滤液,150g离5分钟,收集沉淀重悬于完全培养基,20g离心3分钟,重复2次,沉淀再次重悬于适量完全培养基,加等量9%Ficoll。在15ml锥形离心管中加入5ml 9%Ficoll,再缓慢加入10ml上述制备的沉淀-Ficoll混悬液（约含8～10只乳鼠真皮消化物）,40g离心5分钟,去上清液。沉淀重悬于完全培养基,40g离心5分钟,重复3次,收集沉淀加入适量0.2%Ⅰ型胶原酶置37℃水浴消化1h,用吸管间断吹打,消化完毕,加PBS稀释消化液,450g离心5分钟,去消化液,再加入0.125%胰蛋白酶37℃水浴消化10分钟,加入完全培养基,充分振荡,经25μm筛网（500 TYLER MESH）过滤后收集滤液,450g离心5分钟,重复3次,收集细胞备用。

调整细胞浓度为1×106个／ml,台盼蓝染色法检测细胞存活率,行流式细胞仪检测CD34、CD117表达。细胞沉淀重悬于完全培养基,调整细胞浓度1×105个／ml。取1 ml细胞悬液接种于35mm培养皿（预先把清洁无菌的盖玻片平铺于皿底）,置培养箱1h,去掉培养基,重新加入新鲜培养基置5%CO2培养箱中培养。24h更换一次培养液。细胞生长至80%融合时进行传代培养。

小心吸出旧培养液,用PBS清洗（冲洗）3次,加入适量0.125%胰蛋白酶,使消化液的量能盖住细胞,倒置显微镜下观察消化细胞,若多数细胞出现胞质回缩,细胞之间不再连接成片,弃去胰蛋白酶液,加入新鲜的培养液。用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液,置10ml离心管中,500g离心5min,弃上清液,重复离心洗剂2次,弃去清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液,按1：2进行传代培养。对原代培养细胞及传代培养细胞按试剂盒操作说明行α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和碱性磷酸酶（ALP）染色鉴定。

参考文献

[1]Reorganization of hair follicles in human skin organ culture induced by cultured human follicle‐derived cells[J].WalterKrugluger,WolfgangRohrbacher,KatharinaLaciak,KarlMoser,ClaudiaMoser,JoergHugeneck.Experimental Dermatology.2005(8)

[2]Mast cell deficient and neurokinin-1 receptor knockout mice are protected from stress-induced hair growth inhibition[J].Petra C.Arck,Bori Handjiski,Arne Kuhlmei,Eva M.J.Peters,Maike Knackstedt,Anita Peter,Stephen P.Hunt,Burghard F.Klapp,Ralf Paus.Journal of Molecular Medicine.2005(5)

[3]Apoptosis of the dermal papilla cells of hair follicle associated with the expression of gene HSPCO16 in vitro[J].Wei B.Yang,FeiHao,Zhi Q.Song,Xi C.Yang,BingNi.Experimental Dermatology.2005(3)

[4]Decrease of Nuclear Reactivity to Growth‐regulatory Galectin‐1 in Senescent Human Keratinocytes and Detection of Non‐uniform Staining Profile Alterations upon Prolonged Culture for Galectin‐1 and‐3[J].Anatomia,Histologia,Embryologia.2004(6)

[5]孙锡金.毛囊定向重建实验研究[D].南方医科大学,2010.